一株雌二醇降解细菌的固定化及其对自然水体中雌二醇的降解
本课题采用最适条件下的摇瓶培养法研究了一株雌二醇降解菌的固定化及其对自然水体中雌二醇的降解。以海藻酸钠为固定剂，以固定化菌株对雌二醇的降解率为主要指标，研究了该降解菌的最适固定化条件，以及固定化菌株对自然水体中雌二醇的降解效果。结果表明该降解菌的最适固定化条件为海藻酸钠浓度3.0%，氯化钙浓度2.0%，菌体包埋比1:5，固定化时间8 h。在实验室条件下，固定化菌株的12 d雌二醇降解率为81.0%，较游离菌株提高33.4%。将固定化菌株投入自南京某湖泊采集的水样中，结果表明固定化菌株对实际水体中雌二醇有较好的降解效果，10 d的降解率达60%以上。说明固定化菌株投入实际应用是切实可行的。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.2培养基组成 5
1.3 实验方法 5
1.3.1分析方法5
1.3.2菌悬液的制备5
1.3.3固定化雌二醇降解菌的制备6
1.3.4雌二醇降解效率的测定6
1.3.5固相萃取柱的制作 6
1.3.6水样的前处理 6
1.4 数据分析 6
2结果与分析7
2.1固定化条件的优化7
2.1.1海藻酸钠浓度的影响 7
2.1.2氯化钙浓度的影响 8
2.1.3菌体包埋比的影响 8
2.1.4固定化时间的影响 9
2.2 固定化与游离雌二醇降解菌降解雌二醇性能的研究10
2.3 水样中雌二醇的含量10
2.4 固定化菌株对实际水体中雌二醇的降解11
3讨论12
致谢12
参考文献12
一株雌二醇降解细菌的固定化及其对自然水体中雌二醇的降解
引言
目前，环境雌激素问题已经成为影响人类生存和发展的一个重大问题。环境雌激素问题被喻为威胁人类存亡的定时炸弹，成为继臭氧层破坏、全球气候变暖之后的第三大环境问题[1]。进入21世纪后， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
环境雌激素的污染状况更是令人堪忧。研究表明，美国安大略湖的西北部水体中由于雌激素浓度曾一度高达56 ngL1，从而造成雄鱼雌性化甚至导致了整个湖中的鱼类全部灭绝[2]。而当水体中雌激素17β雌二醇浓度仅为1 ngL1 时，鱼类的内分泌系统就会受到干扰，造成雄鱼的雌性化[3]。随着研究的深入，研究人员发现人类的发育异常以及和生殖相关的一些癌症，如乳腺癌、卵巢癌等，与环境中雌激素的分布水平密切相关[4]。据统计资料，2010年全国畜禽粪便产生量已达45亿吨[5]。而从目前的技术水平看，如此大量的畜禽粪便的主要出路仍然是作有机肥还田[6]。这势必会导致大量的雌激素、氮、磷、病原微生物及其它可能对环境造成危害的粪便污染物质随着畜禽粪便施入农田而进入土壤环境和水环境[7]。此外，生活污水处理厂由于汇集了人类排放的雌激素，作为环境雌激素的一个重要来源，污水处理厂早已受到人们的密切关注[8]。环境雌激素是一类具有雌激素活性，能够模拟或干扰天然雌激素生理和生化作用的化合物。其进入机体后，会干扰体内正常分泌物质的合成、释放、运转、代谢、结合等过程，通过激活或抑制内分泌系统功能，破坏机体的稳定性和调控作用[910]。
17β雌二醇（E2）是天然雌激素的一种，也是作用最强烈的一种，广泛存在于各类环境，尤其是水环境中[11]。17β雌二醇在机体体内合成, 具有内源性激素的活性, 对人类和动物的影响通过模拟、干扰或对抗机体内生激素原有的正常合成、运输和释放，使其无法维持自身的平衡和调节，严重时可引起动物界的雌性化现象[12]。17β雌二醇在环境中的危害极大，主要体现在污染范围广，即使低浓度也可造成明显的影响，且与其它共存的雌激素发生协同作用，通过食物链进行生物富集, 并最终在机体脂肪组织蓄积, 从而形成长期毒害等方面[13]。
17β雌二醇（E2）进入环境的途径主要有三种，分别是动物粪便用作农田肥料进入土壤环境，通过生活污水进入水环境和人工养殖场使用的外加或合成的荷尔蒙等促生长的激素类物质进入环境[14]。而它的降解则以生物降解和光降解为主[15]。其中，生物降解是降解环境中17β雌二醇的重要途径之一，也是本课题使用的方法。
微生物固定化技术是指利用化学或物理手段将游离的微生物固定于一定的空间区域并使其保持活性的一种基本技术[16]。在使用初期，微生物固定化技术主要用于发酵生产[17]。由于固定化降解菌具有细胞密度大、使用周期长、降解效率高等优点, 这项技术在有毒废水生物处理中受到特别重视[18]。微生物固定化的方法很多，主要有物理固定法和化学固定法两种。物理固定法包括吸附法、包埋法和包络法，化学固定法包括交联法和共价结合法等[19]。包埋法是指细菌扩散进入多孔性载体内部或利用高聚物在形成凝胶时将细菌包埋在内部，从而将细菌包裹在小球中的方法[20]。这种方法操作简单，且可以将细菌包围在特定的高分子网络结构中。同时，这种紧密的结构能够防止漏菌，还能允许底物渗透和产物扩散，对细胞活性基本没有大的影响，制得的小球强度和硬度都较高，是目前研究最广泛的方法[21]。包埋法还可以分为高分子合成包埋、离子网络包埋和沉淀包埋[22]。海藻酸钠是由βD甘露糖醛酸和αL葡萄糖醛酸通过14糖苷链连结而成的线状共聚物。它的水溶液电荷密度很高，是一种聚电解质。当它和二价阳离子产生作用时会发生溶胶–凝胶转变，目前广泛应用于很多领域，具有良好的应用前景[23]，也是包埋法中最常用的固定剂。由于包埋法的综合性能较好, 而且制得的固定化降解菌密度高，操作条件温和、固化成形方便，还兼具对微生物毒性小，存活率高等优点[24]，因此，本课题采用海藻酸钠包埋法来进行固定化研究。
本课题以海藻酸钠为固定剂，将固定化后该雌二醇降解细菌对雌二醇的降解效率作为指标，研究该降解细菌固定化的最适条件，以及其对自然水体中雌二醇的降解，以期为该雌二醇降解菌投入生产应用提供理论依据，并确定固定化降解菌的有效性，为高效降解雌二醇，治理环境雌激素污染提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
（1）供试菌株：实验所用雌二醇降解菌株采购自美国模式培养物集存库（ATCC），保存于大学有机污染控制与修复研究所。
（2）包埋剂：海藻酸钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）
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摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.2培养基组成 5
1.3 实验方法 5
1.3.1分析方法5
1.3.2菌悬液的制备5
1.3.3固定化雌二醇降解菌的制备6
1.3.4雌二醇降解效率的测定6
1.3.5固相萃取柱的制作 6
1.3.6水样的前处理 6
1.4 数据分析 6
2结果与分析7
2.1固定化条件的优化7
2.1.1海藻酸钠浓度的影响 7
2.1.2氯化钙浓度的影响 8
2.1.3菌体包埋比的影响 8
2.1.4固定化时间的影响 9
2.2 固定化与游离雌二醇降解菌降解雌二醇性能的研究10
2.3 水样中雌二醇的含量10
2.4 固定化菌株对实际水体中雌二醇的降解11
3讨论12
致谢12
参考文献12
一株雌二醇降解细菌的固定化及其对自然水体中雌二醇的降解
引言
目前，环境雌激素问题已经成为影响人类生存和发展的一个重大问题。环境雌激素问题被喻为威胁人类存亡的定时炸弹，成为继臭氧层破坏、全球气候变暖之后的第三大环境问题[1]。进入21世纪后， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
环境雌激素的污染状况更是令人堪忧。研究表明，美国安大略湖的西北部水体中由于雌激素浓度曾一度高达56 ngL1，从而造成雄鱼雌性化甚至导致了整个湖中的鱼类全部灭绝[2]。而当水体中雌激素17β雌二醇浓度仅为1 ngL1 时，鱼类的内分泌系统就会受到干扰，造成雄鱼的雌性化[3]。随着研究的深入，研究人员发现人类的发育异常以及和生殖相关的一些癌症，如乳腺癌、卵巢癌等，与环境中雌激素的分布水平密切相关[4]。据统计资料，2010年全国畜禽粪便产生量已达45亿吨[5]。而从目前的技术水平看，如此大量的畜禽粪便的主要出路仍然是作有机肥还田[6]。这势必会导致大量的雌激素、氮、磷、病原微生物及其它可能对环境造成危害的粪便污染物质随着畜禽粪便施入农田而进入土壤环境和水环境[7]。此外，生活污水处理厂由于汇集了人类排放的雌激素，作为环境雌激素的一个重要来源，污水处理厂早已受到人们的密切关注[8]。环境雌激素是一类具有雌激素活性，能够模拟或干扰天然雌激素生理和生化作用的化合物。其进入机体后，会干扰体内正常分泌物质的合成、释放、运转、代谢、结合等过程，通过激活或抑制内分泌系统功能，破坏机体的稳定性和调控作用[910]。
17β雌二醇（E2）是天然雌激素的一种，也是作用最强烈的一种，广泛存在于各类环境，尤其是水环境中[11]。17β雌二醇在机体体内合成, 具有内源性激素的活性, 对人类和动物的影响通过模拟、干扰或对抗机体内生激素原有的正常合成、运输和释放，使其无法维持自身的平衡和调节，严重时可引起动物界的雌性化现象[12]。17β雌二醇在环境中的危害极大，主要体现在污染范围广，即使低浓度也可造成明显的影响，且与其它共存的雌激素发生协同作用，通过食物链进行生物富集, 并最终在机体脂肪组织蓄积, 从而形成长期毒害等方面[13]。
17β雌二醇（E2）进入环境的途径主要有三种，分别是动物粪便用作农田肥料进入土壤环境，通过生活污水进入水环境和人工养殖场使用的外加或合成的荷尔蒙等促生长的激素类物质进入环境[14]。而它的降解则以生物降解和光降解为主[15]。其中，生物降解是降解环境中17β雌二醇的重要途径之一，也是本课题使用的方法。
微生物固定化技术是指利用化学或物理手段将游离的微生物固定于一定的空间区域并使其保持活性的一种基本技术[16]。在使用初期，微生物固定化技术主要用于发酵生产[17]。由于固定化降解菌具有细胞密度大、使用周期长、降解效率高等优点, 这项技术在有毒废水生物处理中受到特别重视[18]。微生物固定化的方法很多，主要有物理固定法和化学固定法两种。物理固定法包括吸附法、包埋法和包络法，化学固定法包括交联法和共价结合法等[19]。包埋法是指细菌扩散进入多孔性载体内部或利用高聚物在形成凝胶时将细菌包埋在内部，从而将细菌包裹在小球中的方法[20]。这种方法操作简单，且可以将细菌包围在特定的高分子网络结构中。同时，这种紧密的结构能够防止漏菌，还能允许底物渗透和产物扩散，对细胞活性基本没有大的影响，制得的小球强度和硬度都较高，是目前研究最广泛的方法[21]。包埋法还可以分为高分子合成包埋、离子网络包埋和沉淀包埋[22]。海藻酸钠是由βD甘露糖醛酸和αL葡萄糖醛酸通过14糖苷链连结而成的线状共聚物。它的水溶液电荷密度很高，是一种聚电解质。当它和二价阳离子产生作用时会发生溶胶–凝胶转变，目前广泛应用于很多领域，具有良好的应用前景[23]，也是包埋法中最常用的固定剂。由于包埋法的综合性能较好, 而且制得的固定化降解菌密度高，操作条件温和、固化成形方便，还兼具对微生物毒性小，存活率高等优点[24]，因此，本课题采用海藻酸钠包埋法来进行固定化研究。
本课题以海藻酸钠为固定剂，将固定化后该雌二醇降解细菌对雌二醇的降解效率作为指标，研究该降解细菌固定化的最适条件，以及其对自然水体中雌二醇的降解，以期为该雌二醇降解菌投入生产应用提供理论依据，并确定固定化降解菌的有效性，为高效降解雌二醇，治理环境雌激素污染提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
（1）供试菌株：实验所用雌二醇降解菌株采购自美国模式培养物集存库（ATCC），保存于大学有机污染控制与修复研究所。
（2）包埋剂：海藻酸钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）
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