细胞膜质子泵提高水稻耐铵的研究
目录
摘要 1
引 言 3
1 试验材料 4
1.1 材料 4
1.2 不同铵态氮浓度的营养条件下水稻水培试验 4
1.3 水稻根系和叶片细胞膜蛋白提取 4
1.4 细胞膜H+ATPase水解活性的测定 4
1.5 细胞膜蛋白凝胶电泳和免疫印迹试验 4
1.6 水稻质膜质子泵家族及OsGS家族基因表达分析 4
1.7 数据统计分析 5
2 结果与分析 6
2.1 铵对水稻根系细胞膜质子泵活性、蛋白磷酸化及基因表达的影响 6
2.2 不同铵浓度对水稻根系细胞膜质子泵基因表达的影响 6
2.3 光照与黑暗下，铵浓度对水稻叶片细胞膜质子泵蛋白磷酸化的影响 7
2.4 铵浓度对水稻叶片细胞膜质子泵活性、蛋白及其磷酸化和OsA1基因表达
的影响 9
3 讨论 10
细胞膜质子泵提高水稻耐铵的研究
摘 要
水稻是世界上重要的粮食作物之一，因此提高水稻产量对于保证粮食安全具有重要的意义。由于水稻生活在淹水的土壤环境中，因此主要吸收铵态氮营养为主。如何进一步提高作物碳、氮养分的吸收效率，对于促进农业高产高效具有重要的实践意义。细胞膜上的质子泵（Plasma Membrane H+ ATPase）是高等植物中的一种主宰酶（Master Enzyme）在根系中细胞膜质子泵能够建立膜电位，维持铵态氮吸收，同时能将铵在根细胞中同化产生的氢离子排出细胞，防止细胞质酸化，对保证铵态氮营养的吸收的关键因素。野生型水稻在铵态氮浓度较高时（4mM）生长受到抑制，而OsA1超表达的转基因水稻的生长并没有受到影响，相反长势更好。研究发现，在高浓度铵态氮（4mM）营养下，转基因水稻根际H+浓度是野生型的1.31.5倍，并且叶片和根系细胞膜上质子泵的磷酸化水平和总蛋白含量均比野生型高，活性也增强，说明质子泵基因OsA1超表达后能进一步促进水稻对碳、氮的协同吸收，并排出根细胞中铵同化产生的氢离子。另外，超表达OsA1基因能够促进转基因水稻根系中谷氨酰胺合成酶OsGS1;2表达，从而保证了铵在 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
根系中同化。综上所述，水稻细胞膜质子泵基因OsA1在调控根系吸收铵态氮营养过程中均具有重要的作用。
引言
高等植物主要吸收NH4+ N 和NO3 N两种形式的无机氮源，旱地土壤中通气状况良好，因此易发生硝化作用，大量的NH4+ N被微生物氧化成NO3 N（Gigon et al. 1972；Arth et al. 2000）。而在淹水的土壤中，硝化作用受到抑制，因此土壤中的无机氮以NH4+ N为主。水稻被认为是一种典型的喜铵作物，而大多数旱生作物在单一的NH4+ N营养下容易引起“铵中毒”（Britto et al. 2001; Brix et al.2002）。从植物生理学的原因分析，造成植物铵中毒的可能性大致有三种：第一种可能性是由于地上部光合作物产生的碳架不足以提供地下部根系同化大量吸收的铵（Gerendas et al. 1997）；第二种是由于阳离子竞争吸收，大量的铵离子造成根系对K+, Ca2+ ,Mg2+等大量植物必须的营养元素吸收不足（Kirkby et al.1967; Mengel et al. 1982; Raven et al.1986）；第三种是由于根系吸收和同化NH4+ 过程中会造成根细胞内外酸化（ Speer et al.1994）。由于氮是植物吸收最多的养分，因此所造成的根际酸化作用十分强烈。由于大多数土壤均具有一定的缓冲性能，因此细胞质酸化可能是铵中毒的一个重要的原因（Gerendás et al.2010；Muller et al. 1990）细胞质内的H+会带来很大的问题，导致各种生理活动受到影响，进而导致植物生长生到抑制（Yan et al., 1992）。
植物细胞膜质子泵能够将细胞质内的H+泵出胞外来维持细胞质pH的平衡（Yan et al. 1992; Felle, 1988; Serrano, 1990）。进一步研究发现，即使是水稻，在高浓度的铵营养下生长也会受到胁迫。因此，我们分析水稻质子泵基因超表达的转基因株系和突变体株系中细胞膜质子泵对不同铵浓度响应变化，明确质子泵对水稻耐铵的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
OsA1超表达水稻株系和突变体及野生型日本晴（Nipponbare）水稻
1.2 水稻水培试验
实验所用水稻日本晴，种子用30% NaClO消毒30 min，然后用去离子水浸泡30min置于恒温培养箱中催芽，待生根发芽后转移到光照培养箱中培养。大概7天之后将水稻移到自然环境中培养，并转移到7L培养容器中，营养液每3天更换一次。野生型和OsA1超表达及突变体材料幼苗在含有1、2 、4mM NH4+的IRRI营养液中培养6周。将采取根系和叶片提取RNA以及测定细胞膜质子泵活性。同时将分离好的水稻根系野生型水稻植株根系细胞膜蛋白，在反应体系中加入不同浓度的铵（0、1、2 、4、6、8mM NH4+）检测其细胞膜蛋白的水解活性，每个反应体系加入等量的根系细胞膜蛋白。
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