基于多巴胺固定的钛表面抗凝血性研究
基于多巴胺固定的钛表面抗凝血性研究
生物医用钛合金材料由于其本身具有优良的性质，因而在血液接触材料方面获得广泛的研究应用，但它本身的抗凝血性有待提高。本文通过多巴胺在钛合金表面的固定，进而实现肝素的共价接枝，在钛表面构建了具有抗凝血性能的功能层，提高了钛合金的血液相容性。经傅立叶全反射红外光谱（ATR-FTIR）分析可确定在钛合金表面成功接枝了多巴胺和肝素；通过水接触角的测量可表明钛表面具有良好的亲水性；同时血小板黏附实验表明了多巴胺和肝素的接枝可使血小板的黏附数量和被激活程度有效降低。因此，钛合金经多巴胺和肝素的表面修饰后，其血液相容性得到明显改善，有望成为具有抗凝血功能的新型心血管植入材料。
关键词 钛合金，多巴胺，肝素，抗凝血性
1 绪论1
1.1 问题的提出.1
1.2 血液相容性.1
1.3 材料表面改性.2
1.4 钛合金的血液相容性.3
1.5 制备白蛋白涂层在钛表面改性中的应用.3
1.6 自组装牛血清白蛋白在钛表面改性中的应用.3
1.7 生物活性分子多巴胺...4
1.8 本课题的目的和意义..5
1.9 本课题的技术路线及研究手段.......5
2 实验6
2.1 材料试剂与仪器.....6
2.2 钛合金样品的制备.7
2.3 钛样品的表面改性.8
2.4 材料表面表征.....9
3 实验结果分析....11
3.1 ATR-FTIR分析............定.....11
3.3 血小板黏附实验.....12
结论..15
致谢..16
参考文献..17
1 绪论
1.1 问题的提出
目前钛合金的抗凝血表面改性主要有等离子体聚合提高材料抗凝血性，接枝两性离子聚合物和自组装单层膜法等。其中，基于自组装技术的表面原位化学反应接枝生物活性分子具有广泛的应用。目前用于钛表面自组装的分子主要是硅烷类分子和磷酸类分子，这些分子结合力有限，材料表面接枝密度较低，并且需要比较苛刻的化学反应条件，要在有机溶剂的必要条件下才能发生反应。多巴胺是一种可以在活化钛表面进行牢固结合的生物活性分子，能在水溶液的条件下强力附着于无机和有机材料表面，为材料表面修饰生物分子提供了一个平台[1]。研究结果表明，它可在金属表面形成牢固的结合，可用于材料表面改性。本论文通过多巴胺在钛合金表面的自组装，进一步共价接枝肝素，期望可在表面构建具有抗凝血性能层，从而改善材料血液相容性，为制备新型血液接触类材料探索途径。
1.2 血液相容性
图1-1 血液与生物医用材料接触所导致的凝血过程
材料的血液相容性是指生物材料植入人体后与血液充分碰触，不改变血浆蛋白原有性质，不会使血液中有效成分发生破坏，不会造成凝血和形成血栓的一种性能[2]。图1-1所示的血液与生物材料接触所造成的凝血进程。凝血过程是一个繁杂的化学反应进程，它的实质是纤维蛋白从溶胶形态转别为凝胶形态。同时，在血液凝固中的4种方式，分别是凝血因子的激活、血小板黏附与聚集、红细胞黏附和补体系统的激活[3]。当材料植入人体后，与血液接触，可引起一系列的反应，开始是血液中的蛋白质和脂类将很快在材料表面产生吸附，随后血小板紧紧附着在表面并随之产生汇聚，同时血液中的凝血系统被激活，使得血小板与凝血系统发生相互作用，形成血栓[4]。同时在钙离子的存在下，首先生成的是凝血酶原激活物，它是由于发凝血因子与血小板因子或组织因子相互作用而生成的，接着并激活凝血酶原，转变为凝血酶，而在凝血酶的作用下，纤维蛋白原也改变成成丝状纤维蛋白，同时积聚白细胞，在该过程当中析出血清，构成血栓[5]。
1.3 材料表面改性
具有良好的血液相容性能使生物材料植入人体后发挥关键的作用。生物医用材料因其具有良好的力学性能和一定的生物相容性而用于人体植入器械，但是它们的抗凝血性能较差，所以为了改善材料的血液相容性，材料表面改性是一种有效方式[6]。目前，材料表面改性的主要方式有：
（1）使表面携带负电荷。在人类的血液，因为血管壁是具有负电性的，而且血小板和血浆蛋白质也是带负电荷的，所以人体血液不会发生凝血现象。因此可以利用静电排斥原理，在材料表面植入带有负电荷的基团，可使血液中凝血酶失活，同时通过静电排斥作用使得带负电性的血小板不能发生吸附和聚集，从而提高材料抗凝血性，常用的有带负电的磺酸基和硫酸基。Barbucci等[7]发现硫酸基团带负电，通过与带负电的凝血酶发生静电互斥，使得凝血酶失去活性，从而阻止血小板发生吸附和聚集，达到抗凝血效果。
（2）接枝两性离子聚合物。两性离子聚合物通过静电相互作用之间的电荷的末端基团和氢键，在其表面生成水合层，可以有效地降低材料表面蛋白质的构象，为了抵抗蛋白质非特异性吸附。通过在材料表面植入两性离子聚合物可以有效地改善材料表面的血液相容性。He等[8]研究发现了两性离子磷酰胆碱自组装膜会在表面生成一个细密的水合层，它能够阻止蛋白质吸附到膜表面，可以有效抵抗蛋白质非特异性吸附，从而提高抗凝血性。
（3）设计微相分离结构。人体内的血管壁，从生物材料方面看它们的血液相容性极佳，然而从微观角度上观察人体血管壁，它是一个多相分离结构，则具备微相分离结构的生物材料可具有优良的抗凝血性。具备该结构的生物材料因为是具有某种特定形貌的表面软链段富集，血液中的具有阻止血小板吸附作用的白蛋白会优先被黏附到材料表面，从而提高材料的抗凝血性。聚氨酯就是其中一种。Yaseen等[9]研究发现白蛋白会优先吸附在具有微相分离结构的聚氨酯上，增强了其亲水性，提高了抗凝血效果。
1.4 钛合金的血液相容性
钛合金作为与人体血液接触的医疗器械，其具有与人体组织相适应的物理性能；且对人体血液具有耐腐蚀性能；它还具有良好的生物相容性和血液相容性等一系列优点，而被广泛应用于血液接触类器材的制造，例如心血管系统的心脏瓣膜和血管支架[10]。尽管钛合金具有优良的生物学性能，但是由于自身固有的物理特性和表面特征，在植入人体后迅速产生蛋白质吸附、腐蚀以及对血管壁的损伤，进而引发形成血栓，从而导致植入失败，因此通过钛表面改性从而改善表面抗凝血性因而成为血液接触材料的研究热点。
1.5 制备白蛋白涂层在钛表面改性中的应用
当生物材料植入人体血管，会有大量蛋白质分子吸附在材料表面，形成蛋白质吸附层，随后血液中的凝血因子在蛋白质吸附层上吸附堆积，从而产生血栓，诱发血液凝固。但是当材料表面被一层薄的白蛋白层覆盖住时，能有效阻挡血液中纤维蛋白和血小板在材料表面吸附凝聚，从而能隔离血液中的凝血组织，提高材料表面的抗凝血性，这种现象被称为“白蛋白钝化”。钛合金作为生物医用材料，其拥有良好的生物相容性。为了进一步提高钛合金表面抗凝血性能，可先通过溶胶凝胶法在钛表面制备一层二氧化钛薄膜，然后在盐酸和双氧水的混合溶液、丙烯酰胺和硝酸的混合溶液作用下，对二氧化钛薄膜进行活化处理，随后牛血清白蛋白分子通过静电自组装和共价交联反应后，固定在薄膜上，生成抗凝血涂层。经过对比分析后可发现钛表面亲水性增强，表面血小板黏附数量降低，被激活程度也下降，可知白蛋白涂层能有效改善钛材料血液相容性[11]。
生物医用钛合金材料由于其本身具有优良的性质，因而在血液接触材料方面获得广泛的研究应用，但它本身的抗凝血性有待提高。本文通过多巴胺在钛合金表面的固定，进而实现肝素的共价接枝，在钛表面构建了具有抗凝血性能的功能层，提高了钛合金的血液相容性。经傅立叶全反射红外光谱（ATR-FTIR）分析可确定在钛合金表面成功接枝了多巴胺和肝素；通过水接触角的测量可表明钛表面具有良好的亲水性；同时血小板黏附实验表明了多巴胺和肝素的接枝可使血小板的黏附数量和被激活程度有效降低。因此，钛合金经多巴胺和肝素的表面修饰后，其血液相容性得到明显改善，有望成为具有抗凝血功能的新型心血管植入材料。
关键词 钛合金，多巴胺，肝素，抗凝血性
1 绪论1
1.1 问题的提出.1
1.2 血液相容性.1
1.3 材料表面改性.2
1.4 钛合金的血液相容性.3
1.5 制备白蛋白涂层在钛表面改性中的应用.3
1.6 自组装牛血清白蛋白在钛表面改性中的应用.3
1.7 生物活性分子多巴胺...4
1.8 本课题的目的和意义..5
1.9 本课题的技术路线及研究手段.......5
2 实验6
2.1 材料试剂与仪器.....6
2.2 钛合金样品的制备.7
2.3 钛样品的表面改性.8
2.4 材料表面表征.....9
3 实验结果分析....11
3.1 ATR-FTIR分析............定.....11
3.3 血小板黏附实验.....12
结论..15
致谢..16
参考文献..17
1 绪论
1.1 问题的提出
目前钛合金的抗凝血表面改性主要有等离子体聚合提高材料抗凝血性，接枝两性离子聚合物和自组装单层膜法等。其中，基于自组装技术的表面原位化学反应接枝生物活性分子具有广泛的应用。目前用于钛表面自组装的分子主要是硅烷类分子和磷酸类分子，这些分子结合力有限，材料表面接枝密度较低，并且需要比较苛刻的化学反应条件，要在有机溶剂的必要条件下才能发生反应。多巴胺是一种可以在活化钛表面进行牢固结合的生物活性分子，能在水溶液的条件下强力附着于无机和有机材料表面，为材料表面修饰生物分子提供了一个平台[1]。研究结果表明，它可在金属表面形成牢固的结合，可用于材料表面改性。本论文通过多巴胺在钛合金表面的自组装，进一步共价接枝肝素，期望可在表面构建具有抗凝血性能层，从而改善材料血液相容性，为制备新型血液接触类材料探索途径。
1.2 血液相容性
图1-1 血液与生物医用材料接触所导致的凝血过程
材料的血液相容性是指生物材料植入人体后与血液充分碰触，不改变血浆蛋白原有性质，不会使血液中有效成分发生破坏，不会造成凝血和形成血栓的一种性能[2]。图1-1所示的血液与生物材料接触所造成的凝血进程。凝血过程是一个繁杂的化学反应进程，它的实质是纤维蛋白从溶胶形态转别为凝胶形态。同时，在血液凝固中的4种方式，分别是凝血因子的激活、血小板黏附与聚集、红细胞黏附和补体系统的激活[3]。当材料植入人体后，与血液接触，可引起一系列的反应，开始是血液中的蛋白质和脂类将很快在材料表面产生吸附，随后血小板紧紧附着在表面并随之产生汇聚，同时血液中的凝血系统被激活，使得血小板与凝血系统发生相互作用，形成血栓[4]。同时在钙离子的存在下，首先生成的是凝血酶原激活物，它是由于发凝血因子与血小板因子或组织因子相互作用而生成的，接着并激活凝血酶原，转变为凝血酶，而在凝血酶的作用下，纤维蛋白原也改变成成丝状纤维蛋白，同时积聚白细胞，在该过程当中析出血清，构成血栓[5]。
1.3 材料表面改性
具有良好的血液相容性能使生物材料植入人体后发挥关键的作用。生物医用材料因其具有良好的力学性能和一定的生物相容性而用于人体植入器械，但是它们的抗凝血性能较差，所以为了改善材料的血液相容性，材料表面改性是一种有效方式[6]。目前，材料表面改性的主要方式有：
（1）使表面携带负电荷。在人类的血液，因为血管壁是具有负电性的，而且血小板和血浆蛋白质也是带负电荷的，所以人体血液不会发生凝血现象。因此可以利用静电排斥原理，在材料表面植入带有负电荷的基团，可使血液中凝血酶失活，同时通过静电排斥作用使得带负电性的血小板不能发生吸附和聚集，从而提高材料抗凝血性，常用的有带负电的磺酸基和硫酸基。Barbucci等[7]发现硫酸基团带负电，通过与带负电的凝血酶发生静电互斥，使得凝血酶失去活性，从而阻止血小板发生吸附和聚集，达到抗凝血效果。
（2）接枝两性离子聚合物。两性离子聚合物通过静电相互作用之间的电荷的末端基团和氢键，在其表面生成水合层，可以有效地降低材料表面蛋白质的构象，为了抵抗蛋白质非特异性吸附。通过在材料表面植入两性离子聚合物可以有效地改善材料表面的血液相容性。He等[8]研究发现了两性离子磷酰胆碱自组装膜会在表面生成一个细密的水合层，它能够阻止蛋白质吸附到膜表面，可以有效抵抗蛋白质非特异性吸附，从而提高抗凝血性。
（3）设计微相分离结构。人体内的血管壁，从生物材料方面看它们的血液相容性极佳，然而从微观角度上观察人体血管壁，它是一个多相分离结构，则具备微相分离结构的生物材料可具有优良的抗凝血性。具备该结构的生物材料因为是具有某种特定形貌的表面软链段富集，血液中的具有阻止血小板吸附作用的白蛋白会优先被黏附到材料表面，从而提高材料的抗凝血性。聚氨酯就是其中一种。Yaseen等[9]研究发现白蛋白会优先吸附在具有微相分离结构的聚氨酯上，增强了其亲水性，提高了抗凝血效果。
1.4 钛合金的血液相容性
钛合金作为与人体血液接触的医疗器械，其具有与人体组织相适应的物理性能；且对人体血液具有耐腐蚀性能；它还具有良好的生物相容性和血液相容性等一系列优点，而被广泛应用于血液接触类器材的制造，例如心血管系统的心脏瓣膜和血管支架[10]。尽管钛合金具有优良的生物学性能，但是由于自身固有的物理特性和表面特征，在植入人体后迅速产生蛋白质吸附、腐蚀以及对血管壁的损伤，进而引发形成血栓，从而导致植入失败，因此通过钛表面改性从而改善表面抗凝血性因而成为血液接触材料的研究热点。
1.5 制备白蛋白涂层在钛表面改性中的应用
当生物材料植入人体血管，会有大量蛋白质分子吸附在材料表面，形成蛋白质吸附层，随后血液中的凝血因子在蛋白质吸附层上吸附堆积，从而产生血栓，诱发血液凝固。但是当材料表面被一层薄的白蛋白层覆盖住时，能有效阻挡血液中纤维蛋白和血小板在材料表面吸附凝聚，从而能隔离血液中的凝血组织，提高材料表面的抗凝血性，这种现象被称为“白蛋白钝化”。钛合金作为生物医用材料，其拥有良好的生物相容性。为了进一步提高钛合金表面抗凝血性能，可先通过溶胶凝胶法在钛表面制备一层二氧化钛薄膜，然后在盐酸和双氧水的混合溶液、丙烯酰胺和硝酸的混合溶液作用下，对二氧化钛薄膜进行活化处理，随后牛血清白蛋白分子通过静电自组装和共价交联反应后，固定在薄膜上，生成抗凝血涂层。经过对比分析后可发现钛表面亲水性增强，表面血小板黏附数量降低，被激活程度也下降，可知白蛋白涂层能有效改善钛材料血液相容性[11]。
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