载铜离子肝素多聚赖氨酸纳米颗粒对生物相容性的影响
心血管系统疾病是危害人类健康的重要疾病之一。目前，用于心血管疾病治疗的设备如血管支架，在植入后因为自体生物相容性不足以及抗增生药物造成内皮愈合延迟等原因，往往存在着严重的并发症，如血栓及再狭窄。为了改善生物材料的血液相容性，增强表面内皮再生能力，本论文通过在不锈钢材料表面构建聚多巴胺涂层，并进一步在涂层上固定载铜离子肝素多聚赖氨酸纳米颗粒，从而提高材料表面的生物相容性。利用多聚赖氨酸(PLL)与铜离子及肝素(Hep)之间的交互作用，本论文构建出一种新型的载铜离子的肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒。通过调控生物分子浓度比例可控制纳米颗粒的结构性质。理化性质表征结果显示，铜离子可与多聚赖氨酸中的氨基和醌基发生螯合，构建的纳米颗粒可成功固定于多巴胺表面。根据铜离子掺入浓度不同，纳米颗粒在表面的固定密度也不同。生物相容性评价结果显示，不同工艺纳米颗粒修饰的表面均能够显著抑制血小板的粘附与激活。此外，在一定的颗粒密度范围内，修饰的表面具有促进内皮细胞生长和增殖的能力。关键词：不锈钢；多聚赖氨酸；肝素；纳米颗粒；铜离子；生物相容性目录
第1章 绪 论 1
1.1 研究背景 1
1.2 生物医用不锈钢材料 1
1.3 材料表面抗凝/促内皮双功能修饰的研究进展 2
1.4本课题的研究目的及技术路线 5
第2章 表面功能层构造及其表征 7
2.1实验仪器 7
2.2实验材料与试剂 7
2.3实验内容 8
2.4纳米颗粒性质表征 9
2.5表面功能层理化性质表征 10
2.6生物分子定量检测结果 13
第3章 表面生物相容性评价 16
3.1细胞相容性评价 16
3.2血液相容性评价 19
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
第1章 绪 论
1.1 研究背景
1.1.1冠心病
目前，心血管疾病严重威胁人类的生命健康。根据国际卫生组织统计因心血管疾病的死亡人数逐年上升。在中国，患者已经达到两千万人[1]。而冠心病是一种最常见的心血管疾病，主要是由于给心脏供应血液的冠状动 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
br /> 结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
第1章 绪 论
1.1 研究背景
1.1.1冠心病
目前，心血管疾病严重威胁人类的生命健康。根据国际卫生组织统计因心血管疾病的死亡人数逐年上升。在中国，患者已经达到两千万人[1]。而冠心病是一种最常见的心血管疾病，主要是由于给心脏供应血液的冠状动脉粥样硬化而产生的狭窄，造成心肌供血不足或心肌缺血而引起的功能紊乱。而动脉粥样硬化是一种在动脉血管壁发生的慢性炎症反应。在临床中，一般使用冠脉搭桥术或血管支架介入治疗的方法来治疗。而冠脉搭桥术手术风险高，存在术后有严重的并发症人，工血管顺应性机械性能及自体血管来源不足等问题。相对而言采用血管支架介入治疗的方法没有以上问题成为治疗冠心病的主要手段[2]。
1.1.2 血管支架介入治疗
血管支架介入治疗是将一个可撑开的金属支架套于一根球囊导管的尖端，在血管造影设备的监控下，将球囊导入病变部位，撑开支架以打开狭窄的血管。移除球囊导管后血管支架永久的留在病变部位。这种手术风险低，术后恢复时间短，但是临床结果表示之前使用的金属支架存在生物相容性和力学性能不足的问题，以及血管支架植入和撑开过程中对血管内皮层造成损伤引起血栓形成、炎症反应及内膜过度增生，最终导致如支架血栓及发生再狭窄等不良症状[3]。一旦引起这类症状，就需要再次进行介入手术，而目前的医学的条件下，同一个患者最多进行六次这类手术。后来药物洗脱支架取代了传统的金属支架大大减低了这类反应的存在，但炎症及晚期支架血栓仍然存在，主要是由抗增生药物导致血管内皮愈合延迟及聚合物载体的长期存留引起的。
1.2 生物医用不锈钢材料
生物医用金属材料是用于生物医学材料的金属或合金，又称外科用金属材料，是一类惰性材料。此类材料具有高机械强度、抗疲劳和易加工等优良性能，是临床应用最广泛的承力植入材料。此类材料的应用非常广泛，涉及硬组织、软组织、人工器官和外科辅助器材等各个方面。
其中生物医用不锈钢材料是医用金属中最为常见的一种[4]。不锈钢(316L SS)具有良好的机械性能和优异的抗腐蚀性能，是用于血管支架最常见的金属材料。但是镍、铬酸盐以及钼离子从材料表面的释放会诱发内膜增生与支架内再狭窄，很多材料与方法被尝试用于316L SS 支架的表面修饰以提高生物相容性[5]。使用电化学循环动电位钝化法对316L SS支架的表面进行处理后，表面几乎没有血小板聚集，但存在的问题是该表面对于内皮细胞和平滑肌细胞的粘附没有选择性。
1.3 材料表面抗凝/促内皮双功能修饰的研究进展
1.3.1 抗凝性
血管内支架、心脏瓣膜、人工血管以及其它与血液接触的医疗器件通常是由聚合物或金属材料制成的。它们与血液接触时不可避免地产生不同程度的凝血，形成血栓。血栓的形成可能导致植入器械植入失败，甚至威胁病人生命。因此，在血液接触材料表面制备抗凝血涂层以提高其血液相容性具有非常重要的应用价值。
1.3.2 抗凝/促内皮双功能修饰的研究意义
静止表型的血管内皮细胞能够产生大量抗凝和抗增生因子，因而血管内皮层往往提供一个天然的无血栓形成和抑制血管内膜过度增生的表面。此外，血管内皮层也阻止中膜的平滑肌细胞与血液中的生长因子直接接触，同时能够分泌多种抑制因子如NO和PGI2 以防止SMCs的过度增生[6]，从而避免内膜增生的发生[7]。
鉴于血管内皮层在抗血栓形成和保持平衡中起到重要的作用，因此在血管植入无材料表面形成一层完整的内皮层将是解决术后血栓和狭窄的理想方案。通过材料表面生物功能修饰，在满足血液接触性材料表面抗凝性的要求的基础上，进一步加速表面血管内皮再生，是提高血管支架生物相容性，降低术后并发症发生的有效途径。
1.3.3铜离子（Cu(II)）
在体内，一些金属离子也常作为酶辅因子参与细胞信号通路及生物学应答调控。其中，铜离子作为一种机体必须的微量元素，在调控心血管细胞生物行为及血液行为方面发挥着重要的作用。
近年来的研究表明，铜离子(Cu(II))具有刺激血管内皮细胞增殖及增强血管发生的功能[8]，且当与细胞生长因子如VEGF或FGF-2联合使用时，能更有效的促进胞外胶原基质重建，增强血管再生[9]。此外，Cu(II)还具有催化血液内NO供体（如S-亚硝基硫醇）分解释放NO的能力，而NO则是调控血管内平衡（抑制血小板活化和平滑肌增生）及维持血运通畅的重要分子。Hwang等人[10]将Cu(II)/轮环藤宁复合物共价交联至聚氨酯表面，发现修饰后的材料能催化NO供体释放NO，从而显著提高材料的生物相容性。相似的，Ren等人[11]使用Cu(II)/TPMA螯合物作为NO催化介质引入材料表面，并证明该方法可长期稳定的诱导NO释放，抑制血栓形成。
1.3.4肝素
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等[12]。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。
肝素首先从肝脏发现而得名，它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。天然存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。
低分子量肝素的活性/抗凝血活性的比值为1.5～4.0，而普通的肝素为1，保持了肝素的抗血栓作用而降低了出血的危险。具有半衰期长，生物利用度高等优点，正广泛应用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗，其有效性和安全性均优于普通肝素，量效关系明确，可用固定剂量无需实验室监测调整
第1章 绪 论 1
1.1 研究背景 1
1.2 生物医用不锈钢材料 1
1.3 材料表面抗凝/促内皮双功能修饰的研究进展 2
1.4本课题的研究目的及技术路线 5
第2章 表面功能层构造及其表征 7
2.1实验仪器 7
2.2实验材料与试剂 7
2.3实验内容 8
2.4纳米颗粒性质表征 9
2.5表面功能层理化性质表征 10
2.6生物分子定量检测结果 13
第3章 表面生物相容性评价 16
3.1细胞相容性评价 16
3.2血液相容性评价 19
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
第1章 绪 论
1.1 研究背景
1.1.1冠心病
目前，心血管疾病严重威胁人类的生命健康。根据国际卫生组织统计因心血管疾病的死亡人数逐年上升。在中国，患者已经达到两千万人[1]。而冠心病是一种最常见的心血管疾病，主要是由于给心脏供应血液的冠状动 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
br /> 结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
第1章 绪 论
1.1 研究背景
1.1.1冠心病
目前，心血管疾病严重威胁人类的生命健康。根据国际卫生组织统计因心血管疾病的死亡人数逐年上升。在中国，患者已经达到两千万人[1]。而冠心病是一种最常见的心血管疾病，主要是由于给心脏供应血液的冠状动脉粥样硬化而产生的狭窄，造成心肌供血不足或心肌缺血而引起的功能紊乱。而动脉粥样硬化是一种在动脉血管壁发生的慢性炎症反应。在临床中，一般使用冠脉搭桥术或血管支架介入治疗的方法来治疗。而冠脉搭桥术手术风险高，存在术后有严重的并发症人，工血管顺应性机械性能及自体血管来源不足等问题。相对而言采用血管支架介入治疗的方法没有以上问题成为治疗冠心病的主要手段[2]。
1.1.2 血管支架介入治疗
血管支架介入治疗是将一个可撑开的金属支架套于一根球囊导管的尖端，在血管造影设备的监控下，将球囊导入病变部位，撑开支架以打开狭窄的血管。移除球囊导管后血管支架永久的留在病变部位。这种手术风险低，术后恢复时间短，但是临床结果表示之前使用的金属支架存在生物相容性和力学性能不足的问题，以及血管支架植入和撑开过程中对血管内皮层造成损伤引起血栓形成、炎症反应及内膜过度增生，最终导致如支架血栓及发生再狭窄等不良症状[3]。一旦引起这类症状，就需要再次进行介入手术，而目前的医学的条件下，同一个患者最多进行六次这类手术。后来药物洗脱支架取代了传统的金属支架大大减低了这类反应的存在，但炎症及晚期支架血栓仍然存在，主要是由抗增生药物导致血管内皮愈合延迟及聚合物载体的长期存留引起的。
1.2 生物医用不锈钢材料
生物医用金属材料是用于生物医学材料的金属或合金，又称外科用金属材料，是一类惰性材料。此类材料具有高机械强度、抗疲劳和易加工等优良性能，是临床应用最广泛的承力植入材料。此类材料的应用非常广泛，涉及硬组织、软组织、人工器官和外科辅助器材等各个方面。
其中生物医用不锈钢材料是医用金属中最为常见的一种[4]。不锈钢(316L SS)具有良好的机械性能和优异的抗腐蚀性能，是用于血管支架最常见的金属材料。但是镍、铬酸盐以及钼离子从材料表面的释放会诱发内膜增生与支架内再狭窄，很多材料与方法被尝试用于316L SS 支架的表面修饰以提高生物相容性[5]。使用电化学循环动电位钝化法对316L SS支架的表面进行处理后，表面几乎没有血小板聚集，但存在的问题是该表面对于内皮细胞和平滑肌细胞的粘附没有选择性。
1.3 材料表面抗凝/促内皮双功能修饰的研究进展
1.3.1 抗凝性
血管内支架、心脏瓣膜、人工血管以及其它与血液接触的医疗器件通常是由聚合物或金属材料制成的。它们与血液接触时不可避免地产生不同程度的凝血，形成血栓。血栓的形成可能导致植入器械植入失败，甚至威胁病人生命。因此，在血液接触材料表面制备抗凝血涂层以提高其血液相容性具有非常重要的应用价值。
1.3.2 抗凝/促内皮双功能修饰的研究意义
静止表型的血管内皮细胞能够产生大量抗凝和抗增生因子，因而血管内皮层往往提供一个天然的无血栓形成和抑制血管内膜过度增生的表面。此外，血管内皮层也阻止中膜的平滑肌细胞与血液中的生长因子直接接触，同时能够分泌多种抑制因子如NO和PGI2 以防止SMCs的过度增生[6]，从而避免内膜增生的发生[7]。
鉴于血管内皮层在抗血栓形成和保持平衡中起到重要的作用，因此在血管植入无材料表面形成一层完整的内皮层将是解决术后血栓和狭窄的理想方案。通过材料表面生物功能修饰，在满足血液接触性材料表面抗凝性的要求的基础上，进一步加速表面血管内皮再生，是提高血管支架生物相容性，降低术后并发症发生的有效途径。
1.3.3铜离子（Cu(II)）
在体内，一些金属离子也常作为酶辅因子参与细胞信号通路及生物学应答调控。其中，铜离子作为一种机体必须的微量元素，在调控心血管细胞生物行为及血液行为方面发挥着重要的作用。
近年来的研究表明，铜离子(Cu(II))具有刺激血管内皮细胞增殖及增强血管发生的功能[8]，且当与细胞生长因子如VEGF或FGF-2联合使用时，能更有效的促进胞外胶原基质重建，增强血管再生[9]。此外，Cu(II)还具有催化血液内NO供体（如S-亚硝基硫醇）分解释放NO的能力，而NO则是调控血管内平衡（抑制血小板活化和平滑肌增生）及维持血运通畅的重要分子。Hwang等人[10]将Cu(II)/轮环藤宁复合物共价交联至聚氨酯表面，发现修饰后的材料能催化NO供体释放NO，从而显著提高材料的生物相容性。相似的，Ren等人[11]使用Cu(II)/TPMA螯合物作为NO催化介质引入材料表面，并证明该方法可长期稳定的诱导NO释放，抑制血栓形成。
1.3.4肝素
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等[12]。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。
肝素首先从肝脏发现而得名，它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。天然存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。
低分子量肝素的活性/抗凝血活性的比值为1.5～4.0，而普通的肝素为1，保持了肝素的抗血栓作用而降低了出血的危险。具有半衰期长，生物利用度高等优点，正广泛应用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗，其有效性和安全性均优于普通肝素，量效关系明确，可用固定剂量无需实验室监测调整
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