根瘤菌耐砷工程菌的构建及生理特性研究
亚砷酸转移酶能够催化氧化As(III)，将As(III)转化为MMA，DMA以及挥发性的TMA后，毒性将大大降低且易脱除。通过聚合酶链反应( PCR)从含有砷甲基化基因的质粒pBAM1-ArsMRH.p扩增了三价砷甲基转移酶基因，将arsM定向克隆到pBBR1MCS-5 载体上，构建重组质粒pBBRarsM，通过三亲杂交，在辅助质粒pRK2013的帮助下，将质粒pBBRarsM转移到三叶草根瘤菌ACCC18001中，得到的工程菌pBBRarsM-AS具有As(III) 的耐受性和砷甲基化特性的功能。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 菌种来源 2
1．1．2 试剂和仪器 3
1．1．3 培养基 3
1．2 方法 3
2．1．1 As(III)甲基化基因的克隆与测序 3
2．1．2 表达载体的构建与转化 3
2．1．3 基因工程菌的构建 3
2．1．4 工程菌与原始菌株的抗砷能力试验 3
2．1．5 工程菌中As( III )甲基化能力测定 3
2 结果与分析 3
2．1 A s(III)氧化酶基因克隆与表达载体127pBBR128构建 4
2．2 具有耐砷和高效甲基化砷功能的基因工程菌的构建 4
2．3 菌株对As(Ⅲ)的抗性曲线和耐受能 5
2．4 工程菌对As(III)的甲基化转化能力 6
3 讨论 7
致谢 7
参考文献： 8
根瘤菌耐砷工程菌的构建及生理特性研究
引言
公元1250年Albertus Magnus发现的砷（As）在元素周期表中位于第33位，是一种类金属，广泛存在于岩石圈、水圈和生物圈中，其含量在地壳中为第20位，海水中为第14位，在人体中为第12位 [1]。砷是一种有毒元素，其毒性（如砒霜）早在2000多年前就被人们所认识和利用 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
。它还是一种致癌物质，长期饮用高砷水会导致慢性砷中毒和癌症等疾病[2]。砷在自然界中可以四种氧化价态存在：负三价砷化物，元素砷，三价砷，五价砷，其中元素砷很少存在。
微生物在自然界中广泛参与各种元素的物理、化学和生物化学反应，进而影响诸多元素的迁移转化。尽管砷对人类健康有严重危害，但是自然界某些微生物却能够长期生存在砷含量较高的环境中，有些原核生物(细菌)，包括真细菌(Bacteria)和古细菌(Archaea)甚至能够利用砷的氧化还原价态的转化来获得生存的能量。无机砷还可以被细菌、真菌、酵母等微生物甲基化为MMAA和DMAA等有机砷化合物，以及有毒气体三氢化砷(AsH3)及其甲基化衍生物[3]。在淡水和海水中，一些微生物可以将DMAA转化为更为复杂的有机砷化合物如三甲胂乙内酯和含砷脂质等。五价砷还原的微生物能将三价砷从富砷土壤中释放，导致地下水的污染[4]。微生物能将无机砷转化为气态的甲基砷化物，但是是否微生物能将砷化盐转化为元素砷还需进一步研究。总之，微生物在自然界中长期与砷共存，进化出不同的生物转化机制，主要包括五价砷的还原、三价砷的氧化和砷的甲基化[5]。
Bhattacharjee H &Rosen BP(2007)在原核生物与真核生物的砷代谢研究中，提出在最早期的细胞中遇到的挑战是拥有能对重金属离子及类金属进行解毒和转移的能力[6]。在基因组中ars基因的广泛存在显示它在进化上较古老，而且由于砷在环境中广泛存在，提供选择压力以维持这些基因在现今的活体组织中存在。
砷甲基化在微生物中的过程较明确。Challenger (1945)第一次提出砷甲基化机制：五价砷能通过一系列的五价到三价的还原伴随着氧化甲基化的发生，转化为TMA(III)[7]；Hayakawa et al.(2005)提出另外一种砷甲基化途径，人类砷甲转酶Cyt19将无机的三价砷代谢为甲基砷是通过ATG（砷三谷胱甘肽）和MADG（单甲基砷二谷胱甘肽）作为底物，而不是氧化甲基化，两个途径中关键的一步是将甲基加到三价砷上[8]。
Qin et al. (2006)在对微生物基因组分析的基础上，成功地从Rhodopseudomonas palustris（沼泽红假单胞菌）中克隆了砷甲基化基因arsM，该基因编码一个约283个氨基酸残基（29.656 kDa）的As（III）S腺苷甲基转移酶。该酶能够催化As(III)不同程度甲基化的中间产物，终产物是气态的三甲基砷，将arsM基因整合到砷敏感的E. coli基因组中后，能将培养基中的无机砷转化为DMA、TMA以及三甲基胂氧化物 （TMAO）[9]。
因而, ArsM的解毒机理就是As(III)经三次甲基化后可以转化为气态的有机砷化合物挥发出去(因为在细胞和培养基中检测发现总砷的含量减少了)。此外，arsM的表达受As(III)诱导且受助ArsR类型的阻遏蛋白调控,异源表达发现ArsM能够赋予As(III)敏感菌株砷抗性，这些都充分说明了As(III)甲基化是一个砷解毒机制。由此认为As(Ⅲ)甲基化过程不仅是微生物对砷毒性的适应性过程，亦被认为是理想的砷污染的生物修复过程。
根瘤菌（rhizobia）是一类广泛分布于土壤中并与农业生产关系非常密切的革兰氏阴性细菌，是与豆科植物结瘤的共生固氮细菌的总称。在培养条件下是无芽孢、能运动、好气或微好气的小杆菌，大小一般为 0. 5 ～ 0. 9 ×1. 2 ～ 3. 0μ ｍ，鞭毛周生, 端生或侧生，在 YMA固体培养基上生长成无色透明水珠状菌落，或浅白色菌落。侵入宿主豆科植物在根瘤内后，形态多膨大呈棒状、Ｔ形、Ｙ形和 Ｘ形，此时的根瘤菌称为类菌体 [10]。它们与植物共生形成有效根瘤或茎瘤，以共生体形式将空气中的N2固定为植物可吸收利用的 NH4+。根瘤菌和豆科植物共生固氮体系是目前生物固氮能力最强的体系之一，每年固氮量占全球生物固氮量的65%以上[11]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 菌种来源 2
1．1．2 试剂和仪器 3
1．1．3 培养基 3
1．2 方法 3
2．1．1 As(III)甲基化基因的克隆与测序 3
2．1．2 表达载体的构建与转化 3
2．1．3 基因工程菌的构建 3
2．1．4 工程菌与原始菌株的抗砷能力试验 3
2．1．5 工程菌中As( III )甲基化能力测定 3
2 结果与分析 3
2．1 A s(III)氧化酶基因克隆与表达载体127pBBR128构建 4
2．2 具有耐砷和高效甲基化砷功能的基因工程菌的构建 4
2．3 菌株对As(Ⅲ)的抗性曲线和耐受能 5
2．4 工程菌对As(III)的甲基化转化能力 6
3 讨论 7
致谢 7
参考文献： 8
根瘤菌耐砷工程菌的构建及生理特性研究
引言
公元1250年Albertus Magnus发现的砷（As）在元素周期表中位于第33位，是一种类金属，广泛存在于岩石圈、水圈和生物圈中，其含量在地壳中为第20位，海水中为第14位，在人体中为第12位 [1]。砷是一种有毒元素，其毒性（如砒霜）早在2000多年前就被人们所认识和利用 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
。它还是一种致癌物质，长期饮用高砷水会导致慢性砷中毒和癌症等疾病[2]。砷在自然界中可以四种氧化价态存在：负三价砷化物，元素砷，三价砷，五价砷，其中元素砷很少存在。
微生物在自然界中广泛参与各种元素的物理、化学和生物化学反应，进而影响诸多元素的迁移转化。尽管砷对人类健康有严重危害，但是自然界某些微生物却能够长期生存在砷含量较高的环境中，有些原核生物(细菌)，包括真细菌(Bacteria)和古细菌(Archaea)甚至能够利用砷的氧化还原价态的转化来获得生存的能量。无机砷还可以被细菌、真菌、酵母等微生物甲基化为MMAA和DMAA等有机砷化合物，以及有毒气体三氢化砷(AsH3)及其甲基化衍生物[3]。在淡水和海水中，一些微生物可以将DMAA转化为更为复杂的有机砷化合物如三甲胂乙内酯和含砷脂质等。五价砷还原的微生物能将三价砷从富砷土壤中释放，导致地下水的污染[4]。微生物能将无机砷转化为气态的甲基砷化物，但是是否微生物能将砷化盐转化为元素砷还需进一步研究。总之，微生物在自然界中长期与砷共存，进化出不同的生物转化机制，主要包括五价砷的还原、三价砷的氧化和砷的甲基化[5]。
Bhattacharjee H &Rosen BP(2007)在原核生物与真核生物的砷代谢研究中，提出在最早期的细胞中遇到的挑战是拥有能对重金属离子及类金属进行解毒和转移的能力[6]。在基因组中ars基因的广泛存在显示它在进化上较古老，而且由于砷在环境中广泛存在，提供选择压力以维持这些基因在现今的活体组织中存在。
砷甲基化在微生物中的过程较明确。Challenger (1945)第一次提出砷甲基化机制：五价砷能通过一系列的五价到三价的还原伴随着氧化甲基化的发生，转化为TMA(III)[7]；Hayakawa et al.(2005)提出另外一种砷甲基化途径，人类砷甲转酶Cyt19将无机的三价砷代谢为甲基砷是通过ATG（砷三谷胱甘肽）和MADG（单甲基砷二谷胱甘肽）作为底物，而不是氧化甲基化，两个途径中关键的一步是将甲基加到三价砷上[8]。
Qin et al. (2006)在对微生物基因组分析的基础上，成功地从Rhodopseudomonas palustris（沼泽红假单胞菌）中克隆了砷甲基化基因arsM，该基因编码一个约283个氨基酸残基（29.656 kDa）的As（III）S腺苷甲基转移酶。该酶能够催化As(III)不同程度甲基化的中间产物，终产物是气态的三甲基砷，将arsM基因整合到砷敏感的E. coli基因组中后，能将培养基中的无机砷转化为DMA、TMA以及三甲基胂氧化物 （TMAO）[9]。
因而, ArsM的解毒机理就是As(III)经三次甲基化后可以转化为气态的有机砷化合物挥发出去(因为在细胞和培养基中检测发现总砷的含量减少了)。此外，arsM的表达受As(III)诱导且受助ArsR类型的阻遏蛋白调控,异源表达发现ArsM能够赋予As(III)敏感菌株砷抗性，这些都充分说明了As(III)甲基化是一个砷解毒机制。由此认为As(Ⅲ)甲基化过程不仅是微生物对砷毒性的适应性过程，亦被认为是理想的砷污染的生物修复过程。
根瘤菌（rhizobia）是一类广泛分布于土壤中并与农业生产关系非常密切的革兰氏阴性细菌，是与豆科植物结瘤的共生固氮细菌的总称。在培养条件下是无芽孢、能运动、好气或微好气的小杆菌，大小一般为 0. 5 ～ 0. 9 ×1. 2 ～ 3. 0μ ｍ，鞭毛周生, 端生或侧生，在 YMA固体培养基上生长成无色透明水珠状菌落，或浅白色菌落。侵入宿主豆科植物在根瘤内后，形态多膨大呈棒状、Ｔ形、Ｙ形和 Ｘ形，此时的根瘤菌称为类菌体 [10]。它们与植物共生形成有效根瘤或茎瘤，以共生体形式将空气中的N2固定为植物可吸收利用的 NH4+。根瘤菌和豆科植物共生固氮体系是目前生物固氮能力最强的体系之一，每年固氮量占全球生物固氮量的65%以上[11]。
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