层层自组装载肝素石墨烯涂层的抗凝血性能研究
目录
1 绪论 5
1.1 问题的提出 5
1.2 钛合金的表面改性 5
1.3 石墨烯表面改性应用 6
1.4 层层自组装表面改性技术 6
1.5 材料表面肝素化改性 7
1.6 本课题的目的和意义 8
1.7 本课题的技术路线及研究内容 8
2 实验 9
2.1 材料、试剂与仪器 9
2.2 样品制备 10
2.3 表面结构表征（ATR-FTIR） 12
2.4 表面亲疏水性 12
2.6 内皮细胞行为 13
2.7 血小板粘附实验 13
3 实验结果与分析 13
3.1 红外光谱 13
3.2 表面亲水性 14
3.3 细胞实验 15
3.4 血小板粘附 16
结 论 18
致 谢 19
参 考 文 献 20
1 绪论
1.1 问题的提出
钛合金是应用广泛的生物医用材料，相比于其它材料，其一般具有高耐腐蚀性，与人骨接近的弹性模量[1]。所以钛在20世纪40年代首次用于医学领域，到现在已被广泛应用于生物医用材料，如人工膝关节、骨关节、齿科植入体、牙根及义齿金属支架等。但钛属于生物惰性材料，在应用于生物医用材料时，需要先进行一定的表面改性来提高其生物活性[2]。钛合金的表面改性方法主要分为湿法和干法两大类，其中自组装单层膜法是湿法中一种简单高效能提高钛合金表面活性的方法。
2004年，英国曼彻斯特大学Geim等人通过微机械力剥离高取向热解石墨(HOPG) *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
成功制备并观察到了由一层密集的、处于蜂窝状晶体点阵上的碳原子以sp2杂化连接形成的单原子层二维原子晶体，即石墨烯(Graphene)。它是世界上最薄的新型二维纳米材料[3]。石墨烯优异的电学、力学和热学性质使其在复合材料、传感器、能源等领域具有重要的应用前景[4]。石墨烯具有巨大的比表面积，因此在生物医学领域也有重要应用[5]，这也给钛合金的表面改性带来了新的可能，就是将石墨烯应用于钛合金的表面改性中。
1.2 钛合金的表面改性
由于钛合金诱导磷灰盐沉积的能力差，在形成骨融合前需要进行适当的表面改性来提高表面活性。钛合金的表面改性技术主要分为湿法和干法两大类。表1-1列举了一些常见的表面改性方法。
表1-1 常见的表面改性技术[2]
表面改性方法 特点
溶胶-凝胶法 制备温度低，方法简单
自组装单层膜法 制备温度低，薄膜和基体结合力好，适用于各种形状
水热合成和电化学沉淀法 制备温度低，涂层和基体结合力好
等离子喷涂法 生物陶瓷涂层，涂层与基体间结合力较弱
化学气相沉积 生成化学气体，制备温度较低
离子注入法 较薄的注入层，不影响材料的多数特性
离子束沉积 包括离子束喷射沉积和离子束推动沉积，涂层与基体间结合力较好
在钛合金表面涂层中较多研究的是羟基磷灰石，但在等离子喷涂制备羟基磷灰石涂层过程中，羟基磷灰石在高温下易分解，导致在体液环境下发生脱溶。
生化技术是一种新的表面改性技术，它改变了以往的路线，将大分子蛋白或酶等有机高分子物质直接以化学键的形式连接到经过硅烷化处理和戊二醛作用后的基体表面上[6]。这是一种更直接有效的表面改性方法。
1.3 石墨烯表面改性应用
功能化的氧化石墨烯(GO)及还原氧化石墨烯(rGO)是两种石墨烯衍生物，也是生物医用石墨烯改性的主要目标。氧化石墨烯通常是由石墨经化学氧化、超声制备获得[7]。氧化石墨烯含有大量的含氧活性基团，如羰基、羧基、羟基与环氧基等。环氧基与羟基主要位于氧化石器烯的基面上，而羰基、羧基 则通常分布于氧化石墨烯的边缘处[8]。由于氧化石墨烯上含有大量的含氧活性基团，因此具有良好的生物相容性和水溶液稳定性，同时有利于化学功能化修饰，达到在不同领域应用的目的。
利用含氧活性基团化学反应性不同，可以与多种有特定化学和生物性能的化学基团和功能分子进行共价反应，其中常见的共价修饰方法是通过酰化反应和酯化反应将生物分子或化学基团修饰在石墨烯上。除了共价键功能化外，还可以用π-π相互作用、离子键和氢键等非共价键作用，对石墨烯进行表面功能化修饰[9]。
1.4 层层自组装表面改性技术
层-层自组装(Layer by Layer, LbL)是利用逐层交替沉积的方法, 借助各层分子间的弱相互作用(如静电引力、氢键、配位键等) , 使层与层自发地缔和形成结构完整、性能稳定、具有某种特定功能的分子聚集体或超分子结构的过程。
1966年, Iler就曾利用带相反电荷的胶体粒子通过交替吸附的方法构筑多层结构。1980年, Fromherz在此基础上提出了利用带电荷的蛋白质与线型聚电解质通过交替吸附自组 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
装形成多层结构的概念。直到1991年, 在Decher等首次利用线型的阴、阳离子聚电解质通过静电自组装的方法成功制备了多层复合平板膜之后, 层层自组装技术广为人们接受 [10]。
近年来发展的层层自组装技术主要以离子间的静电作用作为成膜驱动力。即静电层层自组装技术(静电交替沉积技术)。利用这种方法可以控制自组装膜的结构和厚度, 并且由于静电相互作用的非特异性, 可以轻易地将生物功能大分子、导电聚合物、感光聚合物引入到薄膜中去, 形成具有生物功能、导电功能和光活性的薄膜。
层层自组装技术对基质的选取并无特殊限制, 试验中常用的是石英片。基质预处理为清洗基质和表面处理。表面处理是将基质表面处理成亲水的或疏水的, 带正电荷或带负电荷的[11]。
影响静电吸附的因素主要有成膜材料、溶液浓度、清洗和吸附时间等。成膜材料的选择十分关键,需要水溶性的聚电解质, 这是因为每层膜对基质或另一层膜的吸附需要足够数量的离子键。静电层层自组装操作简单、条件温和，特别适合制备具有生物活力的薄膜。通过层层自组装技术制备的生物大分子自组装膜，具有结构高度有序、酶负载量可控等特性，在构筑生物传感器、生物芯片等领域具有重要意义。
1.5 材料表面肝素化改性
肝素（Hep）是一种天然生物活性多糖类化合物, 具有很强的抗凝血性.。采用肝素功能化来提高医用生物材料的抗凝血性能已经有几十年的历史。 肝素通过和抗凝血酶III (AT-III)、肝素结合蛋白(HIP)和血小板因子(PF)等活性物质结合来发挥其生理功能， 起到抗凝血作用。 此外, 肝素分子中含有与多种生长因子结合的位点，能够促进生长因子对细胞增殖、组织或器官修复和再生的作用[12]。
材料表面肝素化改性方法已成功应用于表面涂层，共价修饰及仿生控释载体中，表现出良好的抗凝血性和生物相容性[12]。胡珂[13]等通过在钛材料表面固定多聚赖氨酸-肝素（PLL-Hep）纳米颗粒，成功地提高了样品的亲水性，显著降低了表面血小板粘附数量和激活程度，材料具有很好的抗凝效果。
1.6 本课题的目的和意义
1 绪论 5
1.1 问题的提出 5
1.2 钛合金的表面改性 5
1.3 石墨烯表面改性应用 6
1.4 层层自组装表面改性技术 6
1.5 材料表面肝素化改性 7
1.6 本课题的目的和意义 8
1.7 本课题的技术路线及研究内容 8
2 实验 9
2.1 材料、试剂与仪器 9
2.2 样品制备 10
2.3 表面结构表征（ATR-FTIR） 12
2.4 表面亲疏水性 12
2.6 内皮细胞行为 13
2.7 血小板粘附实验 13
3 实验结果与分析 13
3.1 红外光谱 13
3.2 表面亲水性 14
3.3 细胞实验 15
3.4 血小板粘附 16
结 论 18
致 谢 19
参 考 文 献 20
1 绪论
1.1 问题的提出
钛合金是应用广泛的生物医用材料，相比于其它材料，其一般具有高耐腐蚀性，与人骨接近的弹性模量[1]。所以钛在20世纪40年代首次用于医学领域，到现在已被广泛应用于生物医用材料，如人工膝关节、骨关节、齿科植入体、牙根及义齿金属支架等。但钛属于生物惰性材料，在应用于生物医用材料时，需要先进行一定的表面改性来提高其生物活性[2]。钛合金的表面改性方法主要分为湿法和干法两大类，其中自组装单层膜法是湿法中一种简单高效能提高钛合金表面活性的方法。
2004年，英国曼彻斯特大学Geim等人通过微机械力剥离高取向热解石墨(HOPG) *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
成功制备并观察到了由一层密集的、处于蜂窝状晶体点阵上的碳原子以sp2杂化连接形成的单原子层二维原子晶体，即石墨烯(Graphene)。它是世界上最薄的新型二维纳米材料[3]。石墨烯优异的电学、力学和热学性质使其在复合材料、传感器、能源等领域具有重要的应用前景[4]。石墨烯具有巨大的比表面积，因此在生物医学领域也有重要应用[5]，这也给钛合金的表面改性带来了新的可能，就是将石墨烯应用于钛合金的表面改性中。
1.2 钛合金的表面改性
由于钛合金诱导磷灰盐沉积的能力差，在形成骨融合前需要进行适当的表面改性来提高表面活性。钛合金的表面改性技术主要分为湿法和干法两大类。表1-1列举了一些常见的表面改性方法。
表1-1 常见的表面改性技术[2]
表面改性方法 特点
溶胶-凝胶法 制备温度低，方法简单
自组装单层膜法 制备温度低，薄膜和基体结合力好，适用于各种形状
水热合成和电化学沉淀法 制备温度低，涂层和基体结合力好
等离子喷涂法 生物陶瓷涂层，涂层与基体间结合力较弱
化学气相沉积 生成化学气体，制备温度较低
离子注入法 较薄的注入层，不影响材料的多数特性
离子束沉积 包括离子束喷射沉积和离子束推动沉积，涂层与基体间结合力较好
在钛合金表面涂层中较多研究的是羟基磷灰石，但在等离子喷涂制备羟基磷灰石涂层过程中，羟基磷灰石在高温下易分解，导致在体液环境下发生脱溶。
生化技术是一种新的表面改性技术，它改变了以往的路线，将大分子蛋白或酶等有机高分子物质直接以化学键的形式连接到经过硅烷化处理和戊二醛作用后的基体表面上[6]。这是一种更直接有效的表面改性方法。
1.3 石墨烯表面改性应用
功能化的氧化石墨烯(GO)及还原氧化石墨烯(rGO)是两种石墨烯衍生物，也是生物医用石墨烯改性的主要目标。氧化石墨烯通常是由石墨经化学氧化、超声制备获得[7]。氧化石墨烯含有大量的含氧活性基团，如羰基、羧基、羟基与环氧基等。环氧基与羟基主要位于氧化石器烯的基面上，而羰基、羧基 则通常分布于氧化石墨烯的边缘处[8]。由于氧化石墨烯上含有大量的含氧活性基团，因此具有良好的生物相容性和水溶液稳定性，同时有利于化学功能化修饰，达到在不同领域应用的目的。
利用含氧活性基团化学反应性不同，可以与多种有特定化学和生物性能的化学基团和功能分子进行共价反应，其中常见的共价修饰方法是通过酰化反应和酯化反应将生物分子或化学基团修饰在石墨烯上。除了共价键功能化外，还可以用π-π相互作用、离子键和氢键等非共价键作用，对石墨烯进行表面功能化修饰[9]。
1.4 层层自组装表面改性技术
层-层自组装(Layer by Layer, LbL)是利用逐层交替沉积的方法, 借助各层分子间的弱相互作用(如静电引力、氢键、配位键等) , 使层与层自发地缔和形成结构完整、性能稳定、具有某种特定功能的分子聚集体或超分子结构的过程。
1966年, Iler就曾利用带相反电荷的胶体粒子通过交替吸附的方法构筑多层结构。1980年, Fromherz在此基础上提出了利用带电荷的蛋白质与线型聚电解质通过交替吸附自组 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
装形成多层结构的概念。直到1991年, 在Decher等首次利用线型的阴、阳离子聚电解质通过静电自组装的方法成功制备了多层复合平板膜之后, 层层自组装技术广为人们接受 [10]。
近年来发展的层层自组装技术主要以离子间的静电作用作为成膜驱动力。即静电层层自组装技术(静电交替沉积技术)。利用这种方法可以控制自组装膜的结构和厚度, 并且由于静电相互作用的非特异性, 可以轻易地将生物功能大分子、导电聚合物、感光聚合物引入到薄膜中去, 形成具有生物功能、导电功能和光活性的薄膜。
层层自组装技术对基质的选取并无特殊限制, 试验中常用的是石英片。基质预处理为清洗基质和表面处理。表面处理是将基质表面处理成亲水的或疏水的, 带正电荷或带负电荷的[11]。
影响静电吸附的因素主要有成膜材料、溶液浓度、清洗和吸附时间等。成膜材料的选择十分关键,需要水溶性的聚电解质, 这是因为每层膜对基质或另一层膜的吸附需要足够数量的离子键。静电层层自组装操作简单、条件温和，特别适合制备具有生物活力的薄膜。通过层层自组装技术制备的生物大分子自组装膜，具有结构高度有序、酶负载量可控等特性，在构筑生物传感器、生物芯片等领域具有重要意义。
1.5 材料表面肝素化改性
肝素（Hep）是一种天然生物活性多糖类化合物, 具有很强的抗凝血性.。采用肝素功能化来提高医用生物材料的抗凝血性能已经有几十年的历史。 肝素通过和抗凝血酶III (AT-III)、肝素结合蛋白(HIP)和血小板因子(PF)等活性物质结合来发挥其生理功能， 起到抗凝血作用。 此外, 肝素分子中含有与多种生长因子结合的位点，能够促进生长因子对细胞增殖、组织或器官修复和再生的作用[12]。
材料表面肝素化改性方法已成功应用于表面涂层，共价修饰及仿生控释载体中，表现出良好的抗凝血性和生物相容性[12]。胡珂[13]等通过在钛材料表面固定多聚赖氨酸-肝素（PLL-Hep）纳米颗粒，成功地提高了样品的亲水性，显著降低了表面血小板粘附数量和激活程度，材料具有很好的抗凝效果。
1.6 本课题的目的和意义
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