材料表面肝素纳米颗粒微图形改性研究
目 录
1 绪论 1
1.1 心血管疾病的研究背景 1
1.2 血管支架的三大并发症 1
1.2.1 血栓 1
1.2.2 再狭窄 2
1.2.3炎症 2
1.3 血管支架的表面改性 2
1.4基于多巴胺的表面改性 3
1.5 肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒在多巴胺涂层改性中的研究进展 3
1.5.1 肝素 3
1.5.2 多聚赖氨酸 4
1.5.3 肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒 4
1.6 微图形技术的引入 5
1.7 本课题的研究目的和意义 5
1.8 本课题的研究内容与技术路线 5
2 纳米颗粒微图形表面制备及其表征 7
2.1 纳米颗粒的制备 7
2.1.1 纳米颗粒制备原理 7
2.1.2 纳米颗粒制备参数 7
2.1.3 纳米颗粒表征 7
2.2 纳米颗粒微图形制备及其多巴胺表面的固定 8
2.2.1 实验主要材料与试剂 9
2.2.2 实验主要仪器与设备 10
2.2.3 多巴胺表面微接触印刷肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒 10
2.3 样品表面理化性质表征 12
2.3.1 傅里叶变换红外光谱（FTIR）工作原理 12
2.3.2 表征结果 12
2.3.3 表面形貌 13
2.3.4 亲疏水性表征结果 14
2.4 表面生物分子定量表征 14
2.4.1 甲苯胺蓝定量肝素方法检测原理 14
2.4.2 结果及分析 15
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
> 3 细胞相容性与血液相容性评价 16
3.1 细胞相容性评价 16
3.1.1 内皮细胞的培养 16
3.1.2 内皮细胞的种植与荧光染色 16
3.1.3 细胞培养实验结果及分析 17
3.2 血液相容性评价 19
3.2.1 血小板粘附实验步骤 19
3.2.2 血小板粘附实验结果 19
结 论 21
致 谢 22
参 考 文 献 23
1 绪论
1.1 心血管疾病的研究背景
由于生活水平的提高，加剧了人口老龄化的趋势，因此心血管疾病的发病率也在上升。2008年，全球约1730万人死于心血管疾病，其中超过80%的死亡患者来自贫穷或中等收入国家，更为严重的是至2030年，全球每年将有2300多万人死于心血管疾病。其中冠心病是常见的一类心血管疾病，它是一种由于冠状动脉粥样硬化和狭窄而引发的心脏功能性紊乱。临床上，常使用金属制血管支架（BMS）或药物洗脱支架（DES）植入病变血管处，撑开堵塞的血管，以恢复血流通畅，从而达到治疗的目的。但是，材料植入会导致表面凝血反应和内皮功能紊乱等，这些并发症会导致植入的失败，因此，使用金属支架的安全性和稳定性的问题开始进入研究者们的视线。
因此，通过改变金属材料的表面性能和功能来合理调节血管内生物及生理反应，对改善植入物的生物相容性和安全性有非常重要的医学理论研究价值和临床实际应用意义。
本课题将基于上述现状，利用纳米颗粒制备的样品，结合微图形的技术，期望能在材料表面实现纳米颗粒的有序分布并研究其生物相容性。
1.2 血管支架的三大并发症
1.2.1 血栓
一直以来，血栓依旧是介入治疗后的主要难题，因血栓而造成的死亡率一直居高不下。根据血栓形成的时间可以分为四种[1~2]，第一种是急性血栓，发生在术后的24小时内；第二种是亚急性血栓，发生在术后的30天内；第三种是晚期血栓，发生在术后1年内；第四种是极晚期血栓，发生在术后1年后。由于血栓有较高的死亡率，在临床上患者需要进行长期的治疗和恢复。
1.2.2 再狭窄
在介入治疗后再狭窄的发病率较高[3]，因为一些临床研究证明，使用金属支架的患者，再狭窄的发生率约为20%（15%～40%）[4]，但是如果在术后再次发生再狭窄，患者便急需重新进行介入治疗，这将会使得患者需要承受更多的痛苦和支付额外的治疗费用[5~6]。
1.2.3炎症
炎症的发生率约为6%左右，并且出现的频率有增加的趋势[7~8]。在1993年，Chalmers等报道的金属支架感染的病例，诱发原因就是在右髓总动脉植入Palmaz金属支架后，引发了动脉炎症。我们可以发现如果在介入治疗后引发了炎症感染，将会伴随着较为严重的后果，甚至导致患者的死亡。
因此，如何有效预防血栓形成、再狭窄和炎症，是在冠状动脉内植入血管支架需要长期面对的难题，同时也是当前亟需攻克的难关。
1.3 血管支架的表面改性
316LSS不锈钢具有良好的机械性能和优异的抗腐蚀性能，它是用于血管支架最常见的金属材料[9]。但是由于血液与材料和组织之间引起的一系列血液反应、材料反应和组织反应 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，支架与血液和组织的接触最终会导致的严重后果就是形成血栓和再狭窄，致使手术的失败。因此，植入的血管支架材料不仅要满足优异的物理性能、良好的化学稳定性和无毒性外，而且还需满足生物相容性的要求。生物相容性包括血液相容性和细胞相容性，材料的血液相容性主要包括材料表面抑制血管内血液形成血栓的能力，也就是抗凝血能力，以及不破坏血液成分功能这两方面。抗凝血性主要是指材料不引起血液凝固，不引发血栓形成，这是血液相容性的主要方面，不破坏血液成分功能主要是指不引起材料溶血[10]。细胞相容性是指材料植入人体后,应该能与体内组织形成很好的相容。
研究发现血管内皮层作为血液和血管组织之间的屏障，是一个天然的无血栓形成的表面，这是因为内皮细胞表面含有大量的抗凝成分，能有效抑制血管内膜增生，保持血管长期通畅，因此我们说如果能够在材料表面快速形成一层完整的内皮层将能够有效抑制术后血栓及再狭窄的发生。
研究人员通常是通过对材料进行表面改性以此来改善材料表面生物相容性，这是因为血管支架在体内发生作用首先是在表面上。国内外关于血管支架的表面改性已经取得了一定的进展，但是迄今为止，研究者依然没有找到一种合适的表面功能层构建方法，使表面具有选择性抗凝、抑制内膜增生，同时促进内皮再生的能力。其中最主要的限制来自于生物功能分子在材料表面的正确组合及组装，包括生物活性，固定量及持久性。
因此，如何实现生物功能分子与无机材料的正确连接是当前的技术难题。
1.4基于多巴胺的表面改性
多巴胺，分子式为C6H3（OH）2-CH2-CH2-NH2，是一种生物体内的神经传导物质，结构式如图1-1所示，从图中可以发现，多巴胺含有氨基和羟基基团，是一种新型的“生物胶水”，原因是因为氨基和羟基基团有较强的活性，有研究发现氨基和羟基的高活性有助于多巴胺在材料表面拥有较强的粘结作用[11]。
通过本课题的研究，期望能够通过肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒结合表面微图形技术，实现纳米颗粒在多巴胺涂覆的材料表面有序排列分布，以此来研究纳米颗粒微图形化的表面对血液成分及血管细胞生物行为的调控作用，并阐明其作用机制，有助于在冠状动脉支架植入中一定程度上预防血栓形成和支架内再狭窄，其研究结果具有十分重要的实际意义和科学意义。
1 绪论 1
1.1 心血管疾病的研究背景 1
1.2 血管支架的三大并发症 1
1.2.1 血栓 1
1.2.2 再狭窄 2
1.2.3炎症 2
1.3 血管支架的表面改性 2
1.4基于多巴胺的表面改性 3
1.5 肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒在多巴胺涂层改性中的研究进展 3
1.5.1 肝素 3
1.5.2 多聚赖氨酸 4
1.5.3 肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒 4
1.6 微图形技术的引入 5
1.7 本课题的研究目的和意义 5
1.8 本课题的研究内容与技术路线 5
2 纳米颗粒微图形表面制备及其表征 7
2.1 纳米颗粒的制备 7
2.1.1 纳米颗粒制备原理 7
2.1.2 纳米颗粒制备参数 7
2.1.3 纳米颗粒表征 7
2.2 纳米颗粒微图形制备及其多巴胺表面的固定 8
2.2.1 实验主要材料与试剂 9
2.2.2 实验主要仪器与设备 10
2.2.3 多巴胺表面微接触印刷肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒 10
2.3 样品表面理化性质表征 12
2.3.1 傅里叶变换红外光谱（FTIR）工作原理 12
2.3.2 表征结果 12
2.3.3 表面形貌 13
2.3.4 亲疏水性表征结果 14
2.4 表面生物分子定量表征 14
2.4.1 甲苯胺蓝定量肝素方法检测原理 14
2.4.2 结果及分析 15
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
> 3 细胞相容性与血液相容性评价 16
3.1 细胞相容性评价 16
3.1.1 内皮细胞的培养 16
3.1.2 内皮细胞的种植与荧光染色 16
3.1.3 细胞培养实验结果及分析 17
3.2 血液相容性评价 19
3.2.1 血小板粘附实验步骤 19
3.2.2 血小板粘附实验结果 19
结 论 21
致 谢 22
参 考 文 献 23
1 绪论
1.1 心血管疾病的研究背景
由于生活水平的提高，加剧了人口老龄化的趋势，因此心血管疾病的发病率也在上升。2008年，全球约1730万人死于心血管疾病，其中超过80%的死亡患者来自贫穷或中等收入国家，更为严重的是至2030年，全球每年将有2300多万人死于心血管疾病。其中冠心病是常见的一类心血管疾病，它是一种由于冠状动脉粥样硬化和狭窄而引发的心脏功能性紊乱。临床上，常使用金属制血管支架（BMS）或药物洗脱支架（DES）植入病变血管处，撑开堵塞的血管，以恢复血流通畅，从而达到治疗的目的。但是，材料植入会导致表面凝血反应和内皮功能紊乱等，这些并发症会导致植入的失败，因此，使用金属支架的安全性和稳定性的问题开始进入研究者们的视线。
因此，通过改变金属材料的表面性能和功能来合理调节血管内生物及生理反应，对改善植入物的生物相容性和安全性有非常重要的医学理论研究价值和临床实际应用意义。
本课题将基于上述现状，利用纳米颗粒制备的样品，结合微图形的技术，期望能在材料表面实现纳米颗粒的有序分布并研究其生物相容性。
1.2 血管支架的三大并发症
1.2.1 血栓
一直以来，血栓依旧是介入治疗后的主要难题，因血栓而造成的死亡率一直居高不下。根据血栓形成的时间可以分为四种[1~2]，第一种是急性血栓，发生在术后的24小时内；第二种是亚急性血栓，发生在术后的30天内；第三种是晚期血栓，发生在术后1年内；第四种是极晚期血栓，发生在术后1年后。由于血栓有较高的死亡率，在临床上患者需要进行长期的治疗和恢复。
1.2.2 再狭窄
在介入治疗后再狭窄的发病率较高[3]，因为一些临床研究证明，使用金属支架的患者，再狭窄的发生率约为20%（15%～40%）[4]，但是如果在术后再次发生再狭窄，患者便急需重新进行介入治疗，这将会使得患者需要承受更多的痛苦和支付额外的治疗费用[5~6]。
1.2.3炎症
炎症的发生率约为6%左右，并且出现的频率有增加的趋势[7~8]。在1993年，Chalmers等报道的金属支架感染的病例，诱发原因就是在右髓总动脉植入Palmaz金属支架后，引发了动脉炎症。我们可以发现如果在介入治疗后引发了炎症感染，将会伴随着较为严重的后果，甚至导致患者的死亡。
因此，如何有效预防血栓形成、再狭窄和炎症，是在冠状动脉内植入血管支架需要长期面对的难题，同时也是当前亟需攻克的难关。
1.3 血管支架的表面改性
316LSS不锈钢具有良好的机械性能和优异的抗腐蚀性能，它是用于血管支架最常见的金属材料[9]。但是由于血液与材料和组织之间引起的一系列血液反应、材料反应和组织反应 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，支架与血液和组织的接触最终会导致的严重后果就是形成血栓和再狭窄，致使手术的失败。因此，植入的血管支架材料不仅要满足优异的物理性能、良好的化学稳定性和无毒性外，而且还需满足生物相容性的要求。生物相容性包括血液相容性和细胞相容性，材料的血液相容性主要包括材料表面抑制血管内血液形成血栓的能力，也就是抗凝血能力，以及不破坏血液成分功能这两方面。抗凝血性主要是指材料不引起血液凝固，不引发血栓形成，这是血液相容性的主要方面，不破坏血液成分功能主要是指不引起材料溶血[10]。细胞相容性是指材料植入人体后,应该能与体内组织形成很好的相容。
研究发现血管内皮层作为血液和血管组织之间的屏障，是一个天然的无血栓形成的表面，这是因为内皮细胞表面含有大量的抗凝成分，能有效抑制血管内膜增生，保持血管长期通畅，因此我们说如果能够在材料表面快速形成一层完整的内皮层将能够有效抑制术后血栓及再狭窄的发生。
研究人员通常是通过对材料进行表面改性以此来改善材料表面生物相容性，这是因为血管支架在体内发生作用首先是在表面上。国内外关于血管支架的表面改性已经取得了一定的进展，但是迄今为止，研究者依然没有找到一种合适的表面功能层构建方法，使表面具有选择性抗凝、抑制内膜增生，同时促进内皮再生的能力。其中最主要的限制来自于生物功能分子在材料表面的正确组合及组装，包括生物活性，固定量及持久性。
因此，如何实现生物功能分子与无机材料的正确连接是当前的技术难题。
1.4基于多巴胺的表面改性
多巴胺，分子式为C6H3（OH）2-CH2-CH2-NH2，是一种生物体内的神经传导物质，结构式如图1-1所示，从图中可以发现，多巴胺含有氨基和羟基基团，是一种新型的“生物胶水”，原因是因为氨基和羟基基团有较强的活性，有研究发现氨基和羟基的高活性有助于多巴胺在材料表面拥有较强的粘结作用[11]。
通过本课题的研究，期望能够通过肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒结合表面微图形技术，实现纳米颗粒在多巴胺涂覆的材料表面有序排列分布，以此来研究纳米颗粒微图形化的表面对血液成分及血管细胞生物行为的调控作用，并阐明其作用机制，有助于在冠状动脉支架植入中一定程度上预防血栓形成和支架内再狭窄，其研究结果具有十分重要的实际意义和科学意义。
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