材料表面铜离子螯合型纳米涂层的构建与评价
目 录
1 绪 论 1
1.1 研究背景 1
1.2 血管支架 1
1.3 材料表面抗凝/促内皮双功能修饰的研究进展 2
1.3.1 抗凝性 2
1.3.2 抗凝/促内皮双功能修饰的研究意义 2
1.4 多巴胺涂层 2
1.4.1 多巴胺的结构 2
1.4.2 多巴胺的聚合机理 3
1.5 铜离子和肝素 3
1.5.1 铜离子 3
1.5.1.1 铜离子作用 3
1.5.1.2 铜离子螯合型纳米涂层 4
1.5.2 肝素 4
1.6 该课题研究的意义和目的 5
1.7 本课题的研究内容与技术路线 5
2 实验部分 6
2.1 实验仪器 6
2.2 实验材料与试剂 7
2.3 实验内容 7
2.3.1 载铜离子纳米颗粒的制备 7
2.3.2 纳米颗粒在材料表面的固定 8
2.4 纳米颗粒性质表征 8
2.5 生物分子定量检测结果 9
2.5.1 甲苯胺蓝定量肝素、酸性橙法定量胺基 9
2.6 表面功能层理化性质表征 10
2.6.1 扫描电子显微镜分析 10
2.6.2 傅里叶变换红外光谱分析 11
2.6.3 水接触角 12
3 表面生物相容性评价 13
3.1 血液相容性评价 13
3.1.1 血小板黏附试验 13
3.1.2 实验结果及分析 14 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
3.2 细胞相容性评价 15
3.2.1 内皮细胞的种植与检测 15
结 论 17
致 谢 18
参 考 文 献 19
第1章 绪 论
1.1 研究背景
经济的快速发展，人们生活水平的提高，使得人们生活条件越来越好，良好的物质生活，不规律的饮食习惯，大大提高了疾病的发病率，其中冠心病的发病率很高，属于一种心血管疾病。通过深入认知心血管疾病，动脉粥样硬化是造成心血管疾病的首要因素[1]。动脉硬化会影响血液的流通，同时还会使血管通道变得细小狭窄,甚至会造成动脉血管堵塞[2]对人生命造成威胁。通过介入治疗可以改善冠心病，介入治疗不用开刀，没有大的创伤，伤口恢复很快，治疗效果也好，现在已经成为大多数人推荐的主要治疗手段[3]。
1.2 血管支架
血管成形术是治疗冠脉硬化的一种重要的方法，能使创伤浸入达到最小，打开狭窄或闭塞的血管。在治疗时,通常利用尖嘴球囊导管将血管支架植入,挤压球囊，撑开血管壁,最后撤去导管和球囊,使支架长久的放在在人体内。
植入人体的血液接触材料比如血管内支架或者人工血管等会和血液以及血管内壁接触、也会由于血液-材料-组织这些界面所引起的一系列反应，导致形成血栓和内膜增生等，是手术失败的重要原因。因此,植入的材料不仅要有化学稳定性、易成型加工、物理机械性能和无毒性，而且其生物相容性也要达到一定的条件。上世纪60年代血管支架开始被人们熟知,Dotter等人[4]在1964年第一次提出了在冠状动脉内使用血管支架来支撑血管壁的设想。Sigwart等人[5]1986年首次在人的冠状动脉内放置了第一枚血管支架,在这之后在实际的实验中就经常使用到血管支架。一直发展到现在，需要血管支架具有一些必备的功能，首先指甲要具有良好的可塑性，其次还要求有几何稳定的网状管，血管支架在植入到人体后，要保证其能撑开狭窄的血管，促使血液正常流通，能够缓解患病者的症状。
因此，研究人员急需解决两个问题，一是材料的抑制增生性能，二是材料的抗凝血性能。目前认为,促使生物医用材料表面血管内膜完整性及功能的恢复是解决心血管系统植入器械血栓、抑制血管再狭窄的最佳方法之一[6,7]。
1.3 材料表面抗凝/促内皮双功能修饰的研究进展
1.3.1 抗凝性
医疗器械与血液接触时，会发生不在同一水平的凝血，这种凝血情况无法避免，从而形成血栓。这些与血液直接接触的医疗部件通常由聚合物或者金属材料制成，比如血管内支架、人工血管以及心脏瓣膜。形成血栓后，会造成无法植入器械，严重时对人的生命也有一定的威胁。由此可见，为了改善材料表面的血液相容性，研究好抗凝血涂层置于材料表面相当重要。
1.3.2 抗凝/促内皮双功能修饰的研究意义
静止表型的血管内皮细胞能够产生大量抗凝和抗增生因子，因而血管内皮层往往提供一个天然的无血栓形成和抑制血管内膜过度增生的表面。此外，血管内皮层也阻止中膜的平滑肌细胞与血液中的生长因子直接接触，同时能够分泌多种抑制因子如NO和PGI2 以防止SMCs的过度增生[8]，从而避免内膜增生的发生[9]。
考虑到血管内皮层有某方面重要作用，比如抗血栓形成或者保持平衡，因此，为了达到手术后不发生血栓以及再狭窄，需要一个理 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
想方案，即在血管植入材料表面后要形成一层完整的的内皮层。为了提高血管支架的生物相容性，降低手术后并发症发生，就要对材料表面进行生物功能修饰，并达到血液接触性材料表面抗凝性要求，还要进一步提高血管内皮再生的能力。
1.4多巴胺涂层
1.4.1多巴胺的结构
多巴胺(C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2) 的化学名称为4-(2-氨基乙基)-1,2-苯二酚（4-(2－aminoethyl)benzene-1,2-diol），从图1-1中可以看出，多巴胺包括邻苯二酚羟基基团以及氨基基团，研究显示邻苯二酚羟基基团以及氨基基团有很好的活性，可以和很多材料通过共价以及非共价键形成特别好的作用力，在各种材料表面粘结层起着重要作用[10]。合成多巴胺的前躯物为芳香族氨基酸酪氨酸,通过两次反应变为多巴胺。首先由酪氨酸羟化酶(TH)催化酪氨酸合成左旋3,4-二羟基苯丙氨酸(l-DOPA),再由芳香族氨基酸脱羧酶进一步催化DOPA产生多巴胺。
图1-1多巴胺的化学结构
1.4.2多巴胺的聚合机理
在湿润的碱性的条件下，将基体放在多巴胺溶液里，多巴胺在材料表面沉积成聚多巴胺层。邻苯二酚易于氧化变为苯醌结构，使多巴胺自聚合。目前，没有较为准确的说法来说明多巴胺自聚合，但是很多人都认同一种说法，如图2-2所示：溶解在溶液中的氧和 pH 使多巴胺的邻苯二酚双羟基基团质子化，氧化成 dopaminequinone 结构，当氨基质子化后，分子间发生 1,4 迈克尔环化反应生 leukodopaminechrone ，而 leukodopaminechrone 容易氧化成dopaminechrone，接着进一步分子内重排生成 5, 6-双羟基吲哚，这种结构不稳定容易氧化成吲哚醌。5, 6-双羟基吲哚中的邻苯二酚与 O-醌基之间发生可逆歧化反应使得分子间相互交联，最后聚合成聚多巴胺[11-15]。
2.将准备好的铜离子/多聚赖氨酸混合溶液与肝素溶液等体积混合后，超声处理三分钟，形成载铜离子的纳米颗粒悬浮液；
1 绪 论 1
1.1 研究背景 1
1.2 血管支架 1
1.3 材料表面抗凝/促内皮双功能修饰的研究进展 2
1.3.1 抗凝性 2
1.3.2 抗凝/促内皮双功能修饰的研究意义 2
1.4 多巴胺涂层 2
1.4.1 多巴胺的结构 2
1.4.2 多巴胺的聚合机理 3
1.5 铜离子和肝素 3
1.5.1 铜离子 3
1.5.1.1 铜离子作用 3
1.5.1.2 铜离子螯合型纳米涂层 4
1.5.2 肝素 4
1.6 该课题研究的意义和目的 5
1.7 本课题的研究内容与技术路线 5
2 实验部分 6
2.1 实验仪器 6
2.2 实验材料与试剂 7
2.3 实验内容 7
2.3.1 载铜离子纳米颗粒的制备 7
2.3.2 纳米颗粒在材料表面的固定 8
2.4 纳米颗粒性质表征 8
2.5 生物分子定量检测结果 9
2.5.1 甲苯胺蓝定量肝素、酸性橙法定量胺基 9
2.6 表面功能层理化性质表征 10
2.6.1 扫描电子显微镜分析 10
2.6.2 傅里叶变换红外光谱分析 11
2.6.3 水接触角 12
3 表面生物相容性评价 13
3.1 血液相容性评价 13
3.1.1 血小板黏附试验 13
3.1.2 实验结果及分析 14 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
3.2 细胞相容性评价 15
3.2.1 内皮细胞的种植与检测 15
结 论 17
致 谢 18
参 考 文 献 19
第1章 绪 论
1.1 研究背景
经济的快速发展，人们生活水平的提高，使得人们生活条件越来越好，良好的物质生活，不规律的饮食习惯，大大提高了疾病的发病率，其中冠心病的发病率很高，属于一种心血管疾病。通过深入认知心血管疾病，动脉粥样硬化是造成心血管疾病的首要因素[1]。动脉硬化会影响血液的流通，同时还会使血管通道变得细小狭窄,甚至会造成动脉血管堵塞[2]对人生命造成威胁。通过介入治疗可以改善冠心病，介入治疗不用开刀，没有大的创伤，伤口恢复很快，治疗效果也好，现在已经成为大多数人推荐的主要治疗手段[3]。
1.2 血管支架
血管成形术是治疗冠脉硬化的一种重要的方法，能使创伤浸入达到最小，打开狭窄或闭塞的血管。在治疗时,通常利用尖嘴球囊导管将血管支架植入,挤压球囊，撑开血管壁,最后撤去导管和球囊,使支架长久的放在在人体内。
植入人体的血液接触材料比如血管内支架或者人工血管等会和血液以及血管内壁接触、也会由于血液-材料-组织这些界面所引起的一系列反应，导致形成血栓和内膜增生等，是手术失败的重要原因。因此,植入的材料不仅要有化学稳定性、易成型加工、物理机械性能和无毒性，而且其生物相容性也要达到一定的条件。上世纪60年代血管支架开始被人们熟知,Dotter等人[4]在1964年第一次提出了在冠状动脉内使用血管支架来支撑血管壁的设想。Sigwart等人[5]1986年首次在人的冠状动脉内放置了第一枚血管支架,在这之后在实际的实验中就经常使用到血管支架。一直发展到现在，需要血管支架具有一些必备的功能，首先指甲要具有良好的可塑性，其次还要求有几何稳定的网状管，血管支架在植入到人体后，要保证其能撑开狭窄的血管，促使血液正常流通，能够缓解患病者的症状。
因此，研究人员急需解决两个问题，一是材料的抑制增生性能，二是材料的抗凝血性能。目前认为,促使生物医用材料表面血管内膜完整性及功能的恢复是解决心血管系统植入器械血栓、抑制血管再狭窄的最佳方法之一[6,7]。
1.3 材料表面抗凝/促内皮双功能修饰的研究进展
1.3.1 抗凝性
医疗器械与血液接触时，会发生不在同一水平的凝血，这种凝血情况无法避免，从而形成血栓。这些与血液直接接触的医疗部件通常由聚合物或者金属材料制成，比如血管内支架、人工血管以及心脏瓣膜。形成血栓后，会造成无法植入器械，严重时对人的生命也有一定的威胁。由此可见，为了改善材料表面的血液相容性，研究好抗凝血涂层置于材料表面相当重要。
1.3.2 抗凝/促内皮双功能修饰的研究意义
静止表型的血管内皮细胞能够产生大量抗凝和抗增生因子，因而血管内皮层往往提供一个天然的无血栓形成和抑制血管内膜过度增生的表面。此外，血管内皮层也阻止中膜的平滑肌细胞与血液中的生长因子直接接触，同时能够分泌多种抑制因子如NO和PGI2 以防止SMCs的过度增生[8]，从而避免内膜增生的发生[9]。
考虑到血管内皮层有某方面重要作用，比如抗血栓形成或者保持平衡，因此，为了达到手术后不发生血栓以及再狭窄，需要一个理 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
想方案，即在血管植入材料表面后要形成一层完整的的内皮层。为了提高血管支架的生物相容性，降低手术后并发症发生，就要对材料表面进行生物功能修饰，并达到血液接触性材料表面抗凝性要求，还要进一步提高血管内皮再生的能力。
1.4多巴胺涂层
1.4.1多巴胺的结构
多巴胺(C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2) 的化学名称为4-(2-氨基乙基)-1,2-苯二酚（4-(2－aminoethyl)benzene-1,2-diol），从图1-1中可以看出，多巴胺包括邻苯二酚羟基基团以及氨基基团，研究显示邻苯二酚羟基基团以及氨基基团有很好的活性，可以和很多材料通过共价以及非共价键形成特别好的作用力，在各种材料表面粘结层起着重要作用[10]。合成多巴胺的前躯物为芳香族氨基酸酪氨酸,通过两次反应变为多巴胺。首先由酪氨酸羟化酶(TH)催化酪氨酸合成左旋3,4-二羟基苯丙氨酸(l-DOPA),再由芳香族氨基酸脱羧酶进一步催化DOPA产生多巴胺。
图1-1多巴胺的化学结构
1.4.2多巴胺的聚合机理
在湿润的碱性的条件下，将基体放在多巴胺溶液里，多巴胺在材料表面沉积成聚多巴胺层。邻苯二酚易于氧化变为苯醌结构，使多巴胺自聚合。目前，没有较为准确的说法来说明多巴胺自聚合，但是很多人都认同一种说法，如图2-2所示：溶解在溶液中的氧和 pH 使多巴胺的邻苯二酚双羟基基团质子化，氧化成 dopaminequinone 结构，当氨基质子化后，分子间发生 1,4 迈克尔环化反应生 leukodopaminechrone ，而 leukodopaminechrone 容易氧化成dopaminechrone，接着进一步分子内重排生成 5, 6-双羟基吲哚，这种结构不稳定容易氧化成吲哚醌。5, 6-双羟基吲哚中的邻苯二酚与 O-醌基之间发生可逆歧化反应使得分子间相互交联，最后聚合成聚多巴胺[11-15]。
2.将准备好的铜离子/多聚赖氨酸混合溶液与肝素溶液等体积混合后，超声处理三分钟，形成载铜离子的纳米颗粒悬浮液；
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