双酸腐蚀纯钛粗化表面的构建及性能研究
双酸腐蚀纯钛粗化表面的构建及性能研究
纯钛由于具有适宜的力学性能和良好的耐蚀性，使其成为是医学种植体的首选材料但是它的强度较低，骨整合性较差，限制了它在临床上的应用和发展。因此，通过对纯钛表面进行改性处理提高它的骨整合性。本课题通过不同双酸腐蚀纯钛粗化表面构建拓扑结构来研究其对纯钛生物相容性的影响。本研究结果表明：场发射环境扫描电子显微镜（SEM）分析显示双酸腐蚀后的钛材表面的形貌发生了明显的变化，表面都有不同程度的粗化；接触角测量显示，双酸腐蚀后的纯钛亲水明显提高；血小板粘附实验也表明了双酸腐蚀改性纯钛对血小板粘附能力降低，从而提高了抗凝血性能，进而提高了钛基种植体与宿主的生物相容性。
关键词 双酸腐蚀，拓扑结构，血小板粘附，生物相容性
1 绪论 1
1.1 钛材表面改性的研究背景及意义1
1.2 纯钛种植体粗化表面改性的生物学研究现状2
1.3 钛基材料表面粗化改性方法4
1.4 纯钛种植体酸蚀粗化表面的构建7
1.5 本课题研究的目的、意义和内容8
2 实验9
2.1 实验试剂及仪器9
2.2 实验步骤10
2.3 样品的表征11
3 结果与讨论13
3.1 场发射环境扫描电子显微镜（SEM）13
3.2 接触角的测量14
3.3 血小板粘附的检测16
3.4 讨论17
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 绪论
1.1 钛材表面改性的研究背景及意义
近年来，伴随着生物技术空前迅速的发展以及生活质量水平的进步和提高，医用生物材料已成为人们关注、学者研究的热门领域，这些都促使了人类对生物医用材料的需求。生物医用材料是用来对生物体进行诊断、治疗、修复或替代其他的病损组织、器官，或提高其功能的材料[1]。但其中金属生物医用材料虽然历史源远流长，是人类出现以来最早使用的生物医用材料之一，但其发展进程还是相对比较迟钝的；金属材料它具备其他材料无可超越的高机械强度以及优良抗疲劳性能这两个优点，目前它还是医疗临床上应用最广泛的能承受载荷力的体内植入物。
目前研究和医疗上使用较为频繁的金属生物医用材料主要有钴合金、纯钛及其合金、镁合金、不锈钢、医用贵金属（金，银，铂族元素及其合金）等。之所以这些金属生物医用材料在生物相容性、耐腐蚀性能和力学性能上有非常严格要求，因为它们植入人体后是处于生理环境当中的，其使用环境的复杂程度是实验室无法重现的并且还处于动态反应系统当中。
研究纯钛是因为与其他生物医用金属材料和合金材料相比较，它主要具有以下几个特点[1]：（1）无毒副作用、不致癌、不致畸、不诱发变态反应等；（2）因其表面致密的氧化膜能抵抗多种电解质的腐蚀，包括人体的组织液、唾液等,所以具有良好的耐腐蚀性，（3）适宜的力学性能，纯钛强度适中，硬度较低。由于这些优点使纯钛成为了口腔人工种植牙和颌骨骨折的内固定等外科手术中首选的金属材料。而瑞典哥德堡大学的Branemark[2]教授实验发现高纯度钛与兔子胫骨牢固的结合为现代口腔种植学的提供了理论基础。然而由于钛金属是生物惰性材料，如果直接植入到人体的话，还存在一些现实的问题，例如植入体内的时间过长、骨结合的强度降低、游离金属离子对人体组织的潜在影响等，所以对钛金属表面进行改性处理，改善它表面的生物活性，使其能够与骨组织形成更好的整合，这已经成为了口腔种植材料研究的趋势和热点之一[3]。
由于上述等原因，不能满足临床上的所有要求，因此为了使钛在临床上的应用更加广泛的话，这就要求我们研究出能与生物骨有很好相容性的钛种植体，就出现许多钛种植体表面改性处理方法，重建拓扑结构的达到粗化的目的。如今，表面粗化处理技术已经有了一定的研究规模并已成功地应用于临床上，对钛材表面用喷丸、酸腐蚀、等离子喷涂、碱热处理、激光刻蚀等技术造成钛基材料表面粗糙化的效果；首先，钛材表面的粗化不仅可以增大钛基种植体的表面积和粗糙度，还可以提高机械锁合力，增加种植体初期在体内的稳定性；第二，粗化的表面有利于成骨细胞的粘附、粘附生长化以及功能表达，增加骨结合的能力。喷砂法是一种低廉有效的粗化技术，配合酸腐蚀可以去除喷砂的颗粒和钛表面棱角结构，同时可以生成微米级孔洞甚至纳米结构[4]。所以酸蚀是许多钛材表面改性的前期准备工作之一。
1.2 纯钛种植体粗化表面改性的生物学研究现状
1.2.1 表面粗糙度对生物相容性的影响
早期人们观察到骨在钛植入物表面的附着现象后提出了“骨结合”的说法，通过增加钛基材料表面粗糙度或者其表面的三维结构，可以加强骨在钛表面的锚着。
对于与骨、齿等硬组织接触的种植体材料而言，表面光滑的材料与组织接触后，周围形成的是一层较厚的与材料无结合的包囊组织。增加表面粗糙度可以增加细胞在植入材料表面的粘附、增殖和分化。增加表面粗糙度可以增加植入体与骨组织接触面积，增加机械锁合强度，从而提高了长期在体内的植入体的良性反应。另外，材料的表面粗糙度也是影响血液相容性的重要因素之一。
细胞分化能力在一定程度上是通过酶蛋白反应的，有实验研究证实在粗糙的钛材种植体表面上的细胞外基质蛋白活性可以得到提高。由于很多活性因子在促进种植体骨结合、调节骨生成方面起到了重要作用，而其中种植体表面形态对这些因子的表达和释放的影响是不可忽视的。而大量研究已证明了：不同粗化表面处理方法的种植体作为外源性的信号调节细胞有促进骨生成和诱导因子的作用。
有研究认为在一定范围内，材料表面粗糙度的增加促进了比表面积的扩大；但是却不利于材料表面的湿润性，而这两者都对蛋白质的吸附以及细胞的粘附有一定的影响；所以只有当表面粗糙度和湿润性同时达到所需的要求时，那样才能最大化的促进细胞的粘附。
Ungersbock等[5]通过在老鼠胫骨内植入不同类型的生物材料，通过对包裹或粘附植入物的软组织、细胞数目和组织囊肿进行了大量的分析及研究，表明了钛材表面的组织反应一直是其中最为平淡的。软组织与纯钛接触时，软组织中几本不存在组织囊肿，而且通常在其表面出现了统一取向的组织层。而且，影响软组织反应的并不只有与材料本身的反应有关，表面形貌的差异也会影响其反应。表面高度抛光的种植体使其表面组织能发生相对运动而导致组织对运动的反应，且在接触表面之间会形成液体层；而粗糙面却可以增加摩擦和细胞的增殖反应，能够固定软组织防止形成液体层，这种机制被认为能够抵消微生物污染的蔓延。
有研究证明，鼠的巨噬细胞与不同形貌的种植体复合培养24h后，利用PCR技术分析BMP-2表达的情况，结果：在光滑面上的表达不是很明显，而在酸蚀处理后的粗糙表面上表达尤为明显。
贾爽[6]等有文章研究证明在粗糙的种植体表面上的细胞碱性磷酸酶的活性更高，骨钙素、转移的生长因子β，血小板活化因子E2的释放水平更高，而而这些因素都将有利于骨整合。
1.3.2 不同粗化处理后的钛基种植体对骨结合的影响
近年以来，由于人们对生物医用金属材料的需求量不断增加，研究人员通过将种植物植入动物体中实验来探究粗化处理后种植体的骨结合力。钛基种植体表面粗化后会形成类似窝洞、空洞等的结构,这对骨组织的锚定有重要的作用。到现在为止，已有很多实验研究证实：粗糙的表面相较于平滑的表面更容易与骨整合。
1991年，有研究证明把钛材表面经过喷砂后并进行酸蚀处理的钛基种植体植入到猪的体内，六周后发现钛基材料与骨的结合率为50～60%,而经过电抛处理的平滑面在形同时间内的骨结合率只有20～30%，说明粗糙面更有利于与骨结合。
2001年，周敬才[7]等人发现：在动物体内植入不同表面结构的种植体,在愈合早期，对比发现，粗糙表面的骨界面的剪切强度远远超过光滑的表面,最大可以达到五倍多,而且随时间的延长而增加。
2002年，Grizon[8]在其所做的实验中发现：粗糙和光滑的两个不同表面的钛基材料，在植入羊的股骨后，经过3和6个月后两者在骨量形成多少上虽无特别大的差异，但是，在十二个月和八个月后粗糙表面的骨成形量仍然有增加的趋势，而且骨反应和重建的表现更为强烈。也有人比较了酸腐蚀、机械抛光、羟基磷灰石等离子喷涂和双重酸腐蚀处理后的种植体，经过组织学切片发现除了植入后的第二周以外，双重酸腐蚀处理后的种植体在其它时间过程中都表现出很高的骨结合率，而其它的处理方法并无显著差异。
2003年，Sung-am[9]也曾用类似于的上述的实验证明了相同的结果。粗化表面处理不仅适于牙科种植体并且对于人工髋关节的早期稳固也有着非常重要的作用。
2004年，曹红丹[10]在其论文中写道：将四种相同表面钛基材料经过不同处理的种植体植入到狗的下颌骨,经过3个月的无负荷期后,组织切片发现种植体的骨结合率有明显的差异：机械加工的表面为41.7%,钛浆喷涂的表面为48.9%,等离子喷涂的为57.9%,喷砂酸蚀后表面为68.5%,这就表明了表面粗糙度的不同植入体的骨结合率也是不同的。
2010年，吴奕添[11]等曾写到：在骨质和骨量较差的患者中，阳极氧化形成表面粗糙的种植体与机械加工的光滑表面种植体相比，具有更高的骨接触率，其成高率也比较高。
2013年，李莺[12]等人在其报告也说明，激光处理粗化后的种植体无论是在体内细胞培养还是在体外动物的胫骨实验中全都可以获得比光滑面更佳的生物相容性、早期骨整合。
纯钛由于具有适宜的力学性能和良好的耐蚀性，使其成为是医学种植体的首选材料但是它的强度较低，骨整合性较差，限制了它在临床上的应用和发展。因此，通过对纯钛表面进行改性处理提高它的骨整合性。本课题通过不同双酸腐蚀纯钛粗化表面构建拓扑结构来研究其对纯钛生物相容性的影响。本研究结果表明：场发射环境扫描电子显微镜（SEM）分析显示双酸腐蚀后的钛材表面的形貌发生了明显的变化，表面都有不同程度的粗化；接触角测量显示，双酸腐蚀后的纯钛亲水明显提高；血小板粘附实验也表明了双酸腐蚀改性纯钛对血小板粘附能力降低，从而提高了抗凝血性能，进而提高了钛基种植体与宿主的生物相容性。
关键词 双酸腐蚀，拓扑结构，血小板粘附，生物相容性
1 绪论 1
1.1 钛材表面改性的研究背景及意义1
1.2 纯钛种植体粗化表面改性的生物学研究现状2
1.3 钛基材料表面粗化改性方法4
1.4 纯钛种植体酸蚀粗化表面的构建7
1.5 本课题研究的目的、意义和内容8
2 实验9
2.1 实验试剂及仪器9
2.2 实验步骤10
2.3 样品的表征11
3 结果与讨论13
3.1 场发射环境扫描电子显微镜（SEM）13
3.2 接触角的测量14
3.3 血小板粘附的检测16
3.4 讨论17
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 绪论
1.1 钛材表面改性的研究背景及意义
近年来，伴随着生物技术空前迅速的发展以及生活质量水平的进步和提高，医用生物材料已成为人们关注、学者研究的热门领域，这些都促使了人类对生物医用材料的需求。生物医用材料是用来对生物体进行诊断、治疗、修复或替代其他的病损组织、器官，或提高其功能的材料[1]。但其中金属生物医用材料虽然历史源远流长，是人类出现以来最早使用的生物医用材料之一，但其发展进程还是相对比较迟钝的；金属材料它具备其他材料无可超越的高机械强度以及优良抗疲劳性能这两个优点，目前它还是医疗临床上应用最广泛的能承受载荷力的体内植入物。
目前研究和医疗上使用较为频繁的金属生物医用材料主要有钴合金、纯钛及其合金、镁合金、不锈钢、医用贵金属（金，银，铂族元素及其合金）等。之所以这些金属生物医用材料在生物相容性、耐腐蚀性能和力学性能上有非常严格要求，因为它们植入人体后是处于生理环境当中的，其使用环境的复杂程度是实验室无法重现的并且还处于动态反应系统当中。
研究纯钛是因为与其他生物医用金属材料和合金材料相比较，它主要具有以下几个特点[1]：（1）无毒副作用、不致癌、不致畸、不诱发变态反应等；（2）因其表面致密的氧化膜能抵抗多种电解质的腐蚀，包括人体的组织液、唾液等,所以具有良好的耐腐蚀性，（3）适宜的力学性能，纯钛强度适中，硬度较低。由于这些优点使纯钛成为了口腔人工种植牙和颌骨骨折的内固定等外科手术中首选的金属材料。而瑞典哥德堡大学的Branemark[2]教授实验发现高纯度钛与兔子胫骨牢固的结合为现代口腔种植学的提供了理论基础。然而由于钛金属是生物惰性材料，如果直接植入到人体的话，还存在一些现实的问题，例如植入体内的时间过长、骨结合的强度降低、游离金属离子对人体组织的潜在影响等，所以对钛金属表面进行改性处理，改善它表面的生物活性，使其能够与骨组织形成更好的整合，这已经成为了口腔种植材料研究的趋势和热点之一[3]。
由于上述等原因，不能满足临床上的所有要求，因此为了使钛在临床上的应用更加广泛的话，这就要求我们研究出能与生物骨有很好相容性的钛种植体，就出现许多钛种植体表面改性处理方法，重建拓扑结构的达到粗化的目的。如今，表面粗化处理技术已经有了一定的研究规模并已成功地应用于临床上，对钛材表面用喷丸、酸腐蚀、等离子喷涂、碱热处理、激光刻蚀等技术造成钛基材料表面粗糙化的效果；首先，钛材表面的粗化不仅可以增大钛基种植体的表面积和粗糙度，还可以提高机械锁合力，增加种植体初期在体内的稳定性；第二，粗化的表面有利于成骨细胞的粘附、粘附生长化以及功能表达，增加骨结合的能力。喷砂法是一种低廉有效的粗化技术，配合酸腐蚀可以去除喷砂的颗粒和钛表面棱角结构，同时可以生成微米级孔洞甚至纳米结构[4]。所以酸蚀是许多钛材表面改性的前期准备工作之一。
1.2 纯钛种植体粗化表面改性的生物学研究现状
1.2.1 表面粗糙度对生物相容性的影响
早期人们观察到骨在钛植入物表面的附着现象后提出了“骨结合”的说法，通过增加钛基材料表面粗糙度或者其表面的三维结构，可以加强骨在钛表面的锚着。
对于与骨、齿等硬组织接触的种植体材料而言，表面光滑的材料与组织接触后，周围形成的是一层较厚的与材料无结合的包囊组织。增加表面粗糙度可以增加细胞在植入材料表面的粘附、增殖和分化。增加表面粗糙度可以增加植入体与骨组织接触面积，增加机械锁合强度，从而提高了长期在体内的植入体的良性反应。另外，材料的表面粗糙度也是影响血液相容性的重要因素之一。
细胞分化能力在一定程度上是通过酶蛋白反应的，有实验研究证实在粗糙的钛材种植体表面上的细胞外基质蛋白活性可以得到提高。由于很多活性因子在促进种植体骨结合、调节骨生成方面起到了重要作用，而其中种植体表面形态对这些因子的表达和释放的影响是不可忽视的。而大量研究已证明了：不同粗化表面处理方法的种植体作为外源性的信号调节细胞有促进骨生成和诱导因子的作用。
有研究认为在一定范围内，材料表面粗糙度的增加促进了比表面积的扩大；但是却不利于材料表面的湿润性，而这两者都对蛋白质的吸附以及细胞的粘附有一定的影响；所以只有当表面粗糙度和湿润性同时达到所需的要求时，那样才能最大化的促进细胞的粘附。
Ungersbock等[5]通过在老鼠胫骨内植入不同类型的生物材料，通过对包裹或粘附植入物的软组织、细胞数目和组织囊肿进行了大量的分析及研究，表明了钛材表面的组织反应一直是其中最为平淡的。软组织与纯钛接触时，软组织中几本不存在组织囊肿，而且通常在其表面出现了统一取向的组织层。而且，影响软组织反应的并不只有与材料本身的反应有关，表面形貌的差异也会影响其反应。表面高度抛光的种植体使其表面组织能发生相对运动而导致组织对运动的反应，且在接触表面之间会形成液体层；而粗糙面却可以增加摩擦和细胞的增殖反应，能够固定软组织防止形成液体层，这种机制被认为能够抵消微生物污染的蔓延。
有研究证明，鼠的巨噬细胞与不同形貌的种植体复合培养24h后，利用PCR技术分析BMP-2表达的情况，结果：在光滑面上的表达不是很明显，而在酸蚀处理后的粗糙表面上表达尤为明显。
贾爽[6]等有文章研究证明在粗糙的种植体表面上的细胞碱性磷酸酶的活性更高，骨钙素、转移的生长因子β，血小板活化因子E2的释放水平更高，而而这些因素都将有利于骨整合。
1.3.2 不同粗化处理后的钛基种植体对骨结合的影响
近年以来，由于人们对生物医用金属材料的需求量不断增加，研究人员通过将种植物植入动物体中实验来探究粗化处理后种植体的骨结合力。钛基种植体表面粗化后会形成类似窝洞、空洞等的结构,这对骨组织的锚定有重要的作用。到现在为止，已有很多实验研究证实：粗糙的表面相较于平滑的表面更容易与骨整合。
1991年，有研究证明把钛材表面经过喷砂后并进行酸蚀处理的钛基种植体植入到猪的体内，六周后发现钛基材料与骨的结合率为50～60%,而经过电抛处理的平滑面在形同时间内的骨结合率只有20～30%，说明粗糙面更有利于与骨结合。
2001年，周敬才[7]等人发现：在动物体内植入不同表面结构的种植体,在愈合早期，对比发现，粗糙表面的骨界面的剪切强度远远超过光滑的表面,最大可以达到五倍多,而且随时间的延长而增加。
2002年，Grizon[8]在其所做的实验中发现：粗糙和光滑的两个不同表面的钛基材料，在植入羊的股骨后，经过3和6个月后两者在骨量形成多少上虽无特别大的差异，但是，在十二个月和八个月后粗糙表面的骨成形量仍然有增加的趋势，而且骨反应和重建的表现更为强烈。也有人比较了酸腐蚀、机械抛光、羟基磷灰石等离子喷涂和双重酸腐蚀处理后的种植体，经过组织学切片发现除了植入后的第二周以外，双重酸腐蚀处理后的种植体在其它时间过程中都表现出很高的骨结合率，而其它的处理方法并无显著差异。
2003年，Sung-am[9]也曾用类似于的上述的实验证明了相同的结果。粗化表面处理不仅适于牙科种植体并且对于人工髋关节的早期稳固也有着非常重要的作用。
2004年，曹红丹[10]在其论文中写道：将四种相同表面钛基材料经过不同处理的种植体植入到狗的下颌骨,经过3个月的无负荷期后,组织切片发现种植体的骨结合率有明显的差异：机械加工的表面为41.7%,钛浆喷涂的表面为48.9%,等离子喷涂的为57.9%,喷砂酸蚀后表面为68.5%,这就表明了表面粗糙度的不同植入体的骨结合率也是不同的。
2010年，吴奕添[11]等曾写到：在骨质和骨量较差的患者中，阳极氧化形成表面粗糙的种植体与机械加工的光滑表面种植体相比，具有更高的骨接触率，其成高率也比较高。
2013年，李莺[12]等人在其报告也说明，激光处理粗化后的种植体无论是在体内细胞培养还是在体外动物的胫骨实验中全都可以获得比光滑面更佳的生物相容性、早期骨整合。
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