基于螺旋碳纳米管类酶活性研究及对三聚氰胺的检测
基于螺旋碳纳米管类酶活性研究及对三聚氰胺的检测[20200411171310]
摘 要
在本论文中，我们合成了一种具有螺旋结构的碳纳米管(HCNTs)，并发现这种碳纳米管具有高效的类似过氧化物酶的催化活性。根据这一特性，我们以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和H2O2为底物对其类酶活性进行了研究，结果表明HCNTs具有良好的的稳定性且对TMB以及H2O2都有着很强的亲和力，该催化反应符合Michaelis–Menten动力学理论。因此，HCNTs可以用来检测H2O2。另外，研究表明，混合三聚氰胺和过氧化氢可以生成一种在100 ℃以下很稳定的加成化合物。基于该反应以及HCNTs的类酶活性，我们确立一种新的检测三聚氰胺的方法。该方法灵敏度高，检出限低至1.8 μM。因此，HCNTs在食品安全检测领域有着巨大的应用潜力。
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关键字:螺旋碳纳米管纳米酶类酶活性三聚氰胺
目录
1 绪论 1
1.1 类酶活性的研究 1
1.1.1 生物酶的简介 1
1.1.2 类酶的简介 2
1.2 螺旋碳纳米管的概述 3
1.2.1 碳纳米管的简介 3
1.2.2 螺旋碳纳米管的简介 3
1.3 三聚氰胺的介绍 4
1.4 本论文研究的内容 6
2 实验部分 7
2.1 实验试剂 7
2.2 实验仪器 7
2.3 螺旋碳纳米管的制备 7
2.4 PDDA功能化处理 7
2.5测定方法 8
3 结果与讨论 10
3.1 螺旋碳纳米管的表征 10
3.2 螺旋碳纳米管类酶活性的研究 12
3.2.1 pH值对HCNTs催化活性的影响 12
3.2.2 温度对HCNTs催化活性的影响 13
3.2.3 HCNTs浓度对催化速率的影响 15
3.2.4 以H2O2为底物时HCNTs的表观Km值 16
3.2.5 以TMB为底物时HCNTs的表观Km值 19
3.2.6 米氏常数对比 20
3.3 三聚氰胺的检测 21
4 结语 23
参考文献 24
致谢 25
1 绪论
1.1 类酶活性的研究
1.1.1 生物酶的简介
酶是生物催化剂，是指由生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，主要由蛋白质构成，一小部分由核酸构成[]。酶能够在非常温和的条件下，高效地催化各种生物化学反应，酶在生物体新陈代谢过程中发挥着至关重要的作用，生物体内的各种化学反应几乎都是由酶催化完成的。
酶是生物催化剂，是一种生物大分子。因此，酶与一般催化剂类似，又不同于一般催化剂。与一般催化剂相同的是酶参与生化反应，能降低反应活化能，加快生化反应速率。其次，酶在催化化学反应的前后其本身没有发生变化。另外，酶也具有微量高效的特点，一般只需要少量的酶就能达到理想的催化效果。
因为酶主要由蛋白质组成，所以酶催化也不同于一般催化剂。首先酶催化具有高效性，酶促反应速度比非催化反应高108～1020倍，比一般催化反应高107～1013倍[]。其次，酶催化具有很强的专一性，一般一种酶只作用于一种底物或一类化合物产生一定的反应。另外，由于酶主要由蛋白质构成，所以酶催化具有不稳定性，强酸、强碱、高温等因素可能导致蛋白质变性，从而使酶失去其催化活性。因此，酶催化反应需要在合适的的pH、温度等温和的条件下进行。
目前，解释酶促反应机理最合理学说是中间产物学说，即底物（反应物）S[]先与酶E的活性中心结合生成酶底物复合物[ES]（中间产物），然后[ES]分解为产物P，并释放出E，其机理表示为：
E+S [ES]，[ES] P+E (1)
1913年Leonor Michaelis和Maud Menten在总结前人工作的基础上，经过大量的实验，进一步得出反应速度与底物浓度关系的方程式，这就是著名的米氏方程（michaelismenten equation）：
V0=(Vmax[S])/(Km+[S]) (2)
式中，V0为实际反应速率，Vmax为反应的最大速率，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，该方程是酶促反应动力学的基本方程式。从公式(2)可以得到，当底物浓度[S]=Km时， V0=Vmax/2，因此，Km值是反应速率达到最大速率一半时的底物浓度。所以Km值越小，表示在较低的底物浓度下即可达到最大反应速度，酶与底物的亲和力越大；反之，Km值越大，酶与底物亲和力越小。Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质、酶催化的底物以及反应条件有关，与酶的浓度无关。
1.1.2 类酶的简介
生物酶作为生物催化剂在温和的条件下具有高效性、底物专一的特点。然而，生物酶主要由蛋白质构成，强酸、强碱、高温等因素都会导致蛋白质变性从而使酶失去其催化活性。另外，生物酶在生物体内的含量极低，很难直接从生物体内大量提取，故生物酶的价格十分高昂。因此，寻找可以替代生物酶的材料一直是目前研究的热点。模拟酶 (mimetic enzyme) 是一类由人工设计合成的非蛋白质分子，与生物酶相比，其结构比较简单，对酸、碱、热等较为稳定，同时模拟酶具有生物酶的微量高效、底物专一的特点而且价格低廉容易获取，所以模拟酶开发和应用对催化剂领域的发展具有非常重要的意义。目前模拟酶的设计合成一般采用环糊精、冠醚、卟啉等有机复合物。在纳米酶出现之前，模拟酶一般是指上述的化学酶[5]。
纳米材料由于表面效应、尺寸效应、和宏观量子隧道效应等[]，使材料本身的性质发生了一些特殊的变化，但一般情况下，人们认为纳米材料是化学惰性的物质，其自身不具备生物效应。但是随着纳米科学的高速发展，我国科学家于2007年发现 Fe3O4 纳米颗粒表面不需要任何修饰就具有类似辣根过氧化物酶 (HRP) 的催化活性[]，即Fe3O4 纳米颗粒可催化H2O2与DAB、 TMB、OPD等底物发生氧化反应，并产生与 HRP 催化完全相同的颜色。另外，Fe3O4 纳米颗粒的催化效率、反应动力学参数和催化机制，均与天然的辣根过氧化物酶相类似[5]。辣根过氧化酶是从植物辣根的根部中提取的一种酶，目前广泛用于临床化学、 环境化学、生物分析和食品工业等领域[]。由于HRP价格昂贵，使用条件苛刻，保存困难且容易失活，所以寻找能够替代HRP的模拟酶是目前研究的热点。HRP 纳米酶的出现，迅速改变了人们对纳米材料化学惰性的看法，拓展了纳米材料的研究空间，越来越多的人们投入到了纳米酶的研究中。纳米酶现在已经成为了多学科交叉的研究热点，并逐渐形成了新的研究领域。
自从Fe3O4 纳米颗粒被发现具有与过氧化物酶相类似的催化活性以来，越来越多的纳米材料被发现具有类似酶的催化活性。近几年被报道的有：氧化石墨烯、贵金属掺杂氧化铁、AgPt 、AgAu、AgPd、单壁碳纳米管、FeS、氧化铈等[]。纳米酶作为模拟酶家族的新成员，与传统的模拟酶相比具有非常大的优势，首先纳米酶的催化效率较高，其次纳米酶对热、酸和碱等更加稳定，另外纳米酶可以规模化生产且价格相对较为低廉。因此，纳米酶具有巨大的潜在开发价值，在免疫医学检测、 葡萄糖和双氧水检测、有机污染物清除等多个领域[7]有着广阔的应用前景。
1.2 螺旋碳纳米管的概述
1.2.1 碳纳米管的简介
碳纳米管(Carbon nanotubes，CNT)由日本电镜学家饭岛(Iijima)于1991年首次在高分辨电子显微镜下发现[]，从此开辟了碳材料科学发展的新道路，掀起了研究碳纳米管的热潮。碳纳米管拥有独特的结构以及优异的电子学、力学、化学等性能，因此碳纳米管迅速在纳米电子器件、复合材料、储氢材料、催化剂材料、特殊吸附材料、传感器等[]诸多新兴领域上得到了广泛的应用。近十年来，关于碳纳米管的结构和性质以及制备方法等方面的研究，已经取得了重大的进展，研究重点正转向规模化生产和实际应用领域[8]。
摘 要
在本论文中，我们合成了一种具有螺旋结构的碳纳米管(HCNTs)，并发现这种碳纳米管具有高效的类似过氧化物酶的催化活性。根据这一特性，我们以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和H2O2为底物对其类酶活性进行了研究，结果表明HCNTs具有良好的的稳定性且对TMB以及H2O2都有着很强的亲和力，该催化反应符合Michaelis–Menten动力学理论。因此，HCNTs可以用来检测H2O2。另外，研究表明，混合三聚氰胺和过氧化氢可以生成一种在100 ℃以下很稳定的加成化合物。基于该反应以及HCNTs的类酶活性，我们确立一种新的检测三聚氰胺的方法。该方法灵敏度高，检出限低至1.8 μM。因此，HCNTs在食品安全检测领域有着巨大的应用潜力。
*查看完整论文请 +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:螺旋碳纳米管纳米酶类酶活性三聚氰胺
目录
1 绪论 1
1.1 类酶活性的研究 1
1.1.1 生物酶的简介 1
1.1.2 类酶的简介 2
1.2 螺旋碳纳米管的概述 3
1.2.1 碳纳米管的简介 3
1.2.2 螺旋碳纳米管的简介 3
1.3 三聚氰胺的介绍 4
1.4 本论文研究的内容 6
2 实验部分 7
2.1 实验试剂 7
2.2 实验仪器 7
2.3 螺旋碳纳米管的制备 7
2.4 PDDA功能化处理 7
2.5测定方法 8
3 结果与讨论 10
3.1 螺旋碳纳米管的表征 10
3.2 螺旋碳纳米管类酶活性的研究 12
3.2.1 pH值对HCNTs催化活性的影响 12
3.2.2 温度对HCNTs催化活性的影响 13
3.2.3 HCNTs浓度对催化速率的影响 15
3.2.4 以H2O2为底物时HCNTs的表观Km值 16
3.2.5 以TMB为底物时HCNTs的表观Km值 19
3.2.6 米氏常数对比 20
3.3 三聚氰胺的检测 21
4 结语 23
参考文献 24
致谢 25
1 绪论
1.1 类酶活性的研究
1.1.1 生物酶的简介
酶是生物催化剂，是指由生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，主要由蛋白质构成，一小部分由核酸构成[]。酶能够在非常温和的条件下，高效地催化各种生物化学反应，酶在生物体新陈代谢过程中发挥着至关重要的作用，生物体内的各种化学反应几乎都是由酶催化完成的。
酶是生物催化剂，是一种生物大分子。因此，酶与一般催化剂类似，又不同于一般催化剂。与一般催化剂相同的是酶参与生化反应，能降低反应活化能，加快生化反应速率。其次，酶在催化化学反应的前后其本身没有发生变化。另外，酶也具有微量高效的特点，一般只需要少量的酶就能达到理想的催化效果。
因为酶主要由蛋白质组成，所以酶催化也不同于一般催化剂。首先酶催化具有高效性，酶促反应速度比非催化反应高108～1020倍，比一般催化反应高107～1013倍[]。其次，酶催化具有很强的专一性，一般一种酶只作用于一种底物或一类化合物产生一定的反应。另外，由于酶主要由蛋白质构成，所以酶催化具有不稳定性，强酸、强碱、高温等因素可能导致蛋白质变性，从而使酶失去其催化活性。因此，酶催化反应需要在合适的的pH、温度等温和的条件下进行。
目前，解释酶促反应机理最合理学说是中间产物学说，即底物（反应物）S[]先与酶E的活性中心结合生成酶底物复合物[ES]（中间产物），然后[ES]分解为产物P，并释放出E，其机理表示为：
E+S [ES]，[ES] P+E (1)
1913年Leonor Michaelis和Maud Menten在总结前人工作的基础上，经过大量的实验，进一步得出反应速度与底物浓度关系的方程式，这就是著名的米氏方程（michaelismenten equation）：
V0=(Vmax[S])/(Km+[S]) (2)
式中，V0为实际反应速率，Vmax为反应的最大速率，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，该方程是酶促反应动力学的基本方程式。从公式(2)可以得到，当底物浓度[S]=Km时， V0=Vmax/2，因此，Km值是反应速率达到最大速率一半时的底物浓度。所以Km值越小，表示在较低的底物浓度下即可达到最大反应速度，酶与底物的亲和力越大；反之，Km值越大，酶与底物亲和力越小。Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质、酶催化的底物以及反应条件有关，与酶的浓度无关。
1.1.2 类酶的简介
生物酶作为生物催化剂在温和的条件下具有高效性、底物专一的特点。然而，生物酶主要由蛋白质构成，强酸、强碱、高温等因素都会导致蛋白质变性从而使酶失去其催化活性。另外，生物酶在生物体内的含量极低，很难直接从生物体内大量提取，故生物酶的价格十分高昂。因此，寻找可以替代生物酶的材料一直是目前研究的热点。模拟酶 (mimetic enzyme) 是一类由人工设计合成的非蛋白质分子，与生物酶相比，其结构比较简单，对酸、碱、热等较为稳定，同时模拟酶具有生物酶的微量高效、底物专一的特点而且价格低廉容易获取，所以模拟酶开发和应用对催化剂领域的发展具有非常重要的意义。目前模拟酶的设计合成一般采用环糊精、冠醚、卟啉等有机复合物。在纳米酶出现之前，模拟酶一般是指上述的化学酶[5]。
纳米材料由于表面效应、尺寸效应、和宏观量子隧道效应等[]，使材料本身的性质发生了一些特殊的变化，但一般情况下，人们认为纳米材料是化学惰性的物质，其自身不具备生物效应。但是随着纳米科学的高速发展，我国科学家于2007年发现 Fe3O4 纳米颗粒表面不需要任何修饰就具有类似辣根过氧化物酶 (HRP) 的催化活性[]，即Fe3O4 纳米颗粒可催化H2O2与DAB、 TMB、OPD等底物发生氧化反应，并产生与 HRP 催化完全相同的颜色。另外，Fe3O4 纳米颗粒的催化效率、反应动力学参数和催化机制，均与天然的辣根过氧化物酶相类似[5]。辣根过氧化酶是从植物辣根的根部中提取的一种酶，目前广泛用于临床化学、 环境化学、生物分析和食品工业等领域[]。由于HRP价格昂贵，使用条件苛刻，保存困难且容易失活，所以寻找能够替代HRP的模拟酶是目前研究的热点。HRP 纳米酶的出现，迅速改变了人们对纳米材料化学惰性的看法，拓展了纳米材料的研究空间，越来越多的人们投入到了纳米酶的研究中。纳米酶现在已经成为了多学科交叉的研究热点，并逐渐形成了新的研究领域。
自从Fe3O4 纳米颗粒被发现具有与过氧化物酶相类似的催化活性以来，越来越多的纳米材料被发现具有类似酶的催化活性。近几年被报道的有：氧化石墨烯、贵金属掺杂氧化铁、AgPt 、AgAu、AgPd、单壁碳纳米管、FeS、氧化铈等[]。纳米酶作为模拟酶家族的新成员，与传统的模拟酶相比具有非常大的优势，首先纳米酶的催化效率较高，其次纳米酶对热、酸和碱等更加稳定，另外纳米酶可以规模化生产且价格相对较为低廉。因此，纳米酶具有巨大的潜在开发价值，在免疫医学检测、 葡萄糖和双氧水检测、有机污染物清除等多个领域[7]有着广阔的应用前景。
1.2 螺旋碳纳米管的概述
1.2.1 碳纳米管的简介
碳纳米管(Carbon nanotubes，CNT)由日本电镜学家饭岛(Iijima)于1991年首次在高分辨电子显微镜下发现[]，从此开辟了碳材料科学发展的新道路，掀起了研究碳纳米管的热潮。碳纳米管拥有独特的结构以及优异的电子学、力学、化学等性能，因此碳纳米管迅速在纳米电子器件、复合材料、储氢材料、催化剂材料、特殊吸附材料、传感器等[]诸多新兴领域上得到了广泛的应用。近十年来，关于碳纳米管的结构和性质以及制备方法等方面的研究，已经取得了重大的进展，研究重点正转向规模化生产和实际应用领域[8]。
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