糖尿病患者牙种植影响因素探析
糖尿病是一种严重威胁人类健康生命的代谢性疾病.糖尿病患者常伴随骨代谢障碍和钙.磷代谢紊乱,可以引起继发性骨量减少及骨质疏松等糖尿病骨病.患者颌骨也会表现出相关变化,如牙槽骨萎缩及颌骨骨质疏松,继而引起牙齿的松动及脱落[2].临床研究发现[3],糖尿病患者相对于非糖尿病患者而言,更易患牙周疾病.伴随着 更多精彩就在： 51免费论文网|www.hbsrm.com
种植技术的发展,种植牙是口腔缺失牙修复的重要方式,但糖尿病导致的骨骼并发症和异常代谢环境所致病理变化却极大降低了牙种植的成功率[4].糖尿病患者体内包含多种因素的改变,如血糖.相关激素及生长因子等,血糖的变化是比较直接的因素[5].现在大部分体外研究采用高糖培养基模拟糖尿病状态,研究高糖环境对骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,MSCs)的影响成为了目前关注的热点.有研究指出[6],颌骨骨髓间充质干细胞(orofacialbonemesenchymalstemcells,OFMSCs)与长骨MSCs不一样.鉴于目前的研究都集中于长骨MSCs而对OFMSCs的研究甚少,本实验在体外模拟不同糖浓度,观察评价不同糖浓度对大鼠OFMSCs增殖和成骨能力的影响,为进一步阐明糖尿病骨代谢障碍分子机制提供实验基础.1材料和方法1.1动物和主要试剂4周龄SD大鼠(由重庆医科大学提供),所有SD大鼠均根据中国重庆医科大学动物伦理委员会试验协议进行处置.胎牛血清(FBS).α-MEM培养基(Gibco,美国).葡萄糖.地塞米松.β-甘油磷酸钠.抗坏血酸(Sigma,美国).TrizolReagent(Invitrogen,美国),RT-PCR试剂盒(TaKaRa,日本).成脂诱导液(百思维,中国).0.25%胰酶.磷酸盐缓冲液.CCK-8试剂盒.碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒.茜素红染液等均为国产纯化级试剂.1.2OFMSCs的体外培养通过贴壁法与差速离心法获取OFMSCs.将4周龄雄性SD大鼠脱颈处死,体积分数75%乙醇浸泡3min,在超净工作台内取出下颌骨,仔细去除颌骨上附着的肌肉组织,暴露骨髓腔.5mL注射器吸取不含血清预冷的培养基反复冲洗骨髓腔,再按贴壁法培养OFMSCs.当OFMSCs生长到相互融合(约80%左右)传代培养,取第3代细胞进行实验.1.3OFMSCs成骨.成脂.成软骨诱导和鉴定成骨诱导鉴定：OFMSCs按每孔1×105的密度接种于6孔板中,细胞融合后(约80%左右)换成骨诱导液(α-MEM培养基中含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠.10-7mol/L地塞米松.50μg/mL抗坏血酸及10%FBS)培养,每2d换液,连续培养21d,再进行常规茜素红染色.成脂诱导鉴定：OFMSCs接种同上,换成脂诱导液培养,每2d换液,培养14d,再进行常规油红O染色.成软骨诱导鉴定：OFMSCs接种同上,换成软骨诱导液培养,每2d换液,培养14d,再进行常规阿利新蓝染色.1.4定量检测不同糖浓度对茜素红染色和矿化基质的影响实验分组为使用不同含糖量培养基(5.5.11.16.5.25.44mmol/L)培养OFMSCs,以5.5mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组.OFMSCs按每孔1×105的密度接种于6孔板,24h后更换不同含糖量的培养基,21d茜素红染色,光镜下观察钙结节.再于每孔中加入1mL抽提液(2%乙酸溶液与无水乙醇之比为8∶2)30min,避光,将每孔溶液分装到96孔板中,100μL/孔,于490nm波长下记录各孔吸光度(A)值.1.5检测不同糖浓度对细胞增殖的影响CCK-8法：OFMSCs按每孔1×103的密度接种于96孔板,细胞完全贴壁后用不含血清的培养基饥饿处理24h后更换不同含糖量的培养基.每孔中加入10μLCCK-8试剂,37℃孵箱3.5h,于450nm波长下测定A值,每组每天测3孔,连续测6d,绘制细胞增殖曲线.流式细胞术：OFMSCs饥饿处理后,采用不同糖浓度培养基常规培养4d,消化后制成细胞悬液2×106/mL,加入体积分数70%的预冷乙醇1.5mL,40℃过夜,离心后弃乙醇,PBS清洗2遍,最后加入碘化丙锭1mL,避光染色30min,流式细胞仪上机检测细胞DNA含量.进行细胞周期分析,计算增殖指数(proliferationindex,PI).1.6检测不同糖浓度对ALP活性的影响OFMSCs按每孔2×104的密度接种于24孔板,24h后更换不同含糖浓度的成骨诱导液,4.7d收集细胞.每管中加50μL0.2%TritonX-100,4℃过夜,裂解细胞.按试剂盒说明相应加入1液.2液和3液,充分混匀,立即接种于96孔板中,每组设置3个复孔,于波长520nm测定A值.1.7RT-PCR检测不同糖浓度对Runx2.OsterixmRNA表达的影响根据NCBI中大鼠β-actin.Runx2.Osterix基因序列,由金斯瑞生物科技有限公司进行引物设计及质量检测.引物序列如下.Runx2上游引物序列：5′-CCGAGACCAACCGAGTCATTTA-3′,下游引物序列：5′-AAGAGGCTGTTTGACGCCAT-3′；Osterix上游引物序列：5′-GCCAGTAATCTTCGTGCCAG-3′,下游引物序列：5′-TAGTGAGCTTCTTCCTGGGGA-3′；β-actin上游引物序列：5′-CCCGCGAGTACAACCTTCTTG-3′,下游引物序列：5′-GTCATCCATGGCGAACTGGTG-3′.培养OFMSCs24h后更换不同含糖浓度的成骨诱导液,诱导3.7.14及21d用TRIzol提取细胞RNA,用TaKaRa逆转录试剂盒逆转录RNA为稳定的cDNA,以cDNA为模板,用SYBRGreen法实时荧光定量检测PCR.采用β-actin为参照,ΔCt相对定量分析,样本平均相对含量倍数为2-ΔΔCt.1.8统计学方法实验数据以珚x±s表示.采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1OFMSCs细胞形态培养第3代的OFMSCs呈明显的漩涡状”生长(图1).2.2OFMSCs成骨.成脂.成软骨分化能力的鉴定OFMSCs成骨诱导21d后茜素红染色可见明显的钙结节(图2A)；成脂诱导14d后油红O染色可见红色脂滴(图2B)；成软骨诱导14d后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆(图2C).2.3茜素红染色及其定量分析成骨诱导21d,茜素红染色(图3)显示,随着培养液糖浓度的升高,钙结节形成减少.矿化定量分析观察,对照组(5.5mmol/L糖浓度)的A值(2.735±0.480)高于实验组(11.16.5.25.44mmol/L糖浓度的A值分别为1.613±0.219.1.165±0.220.0.811±0.019.0.611±0.006),P均<0.05.2.4不同糖浓度对细胞增殖的影响第1天各组细胞生长缓慢,差异无统计学意义,从第2天开始细胞进入对数生长期,生长迅速.第2天至第6天,在5.5~25mmol/L糖浓度范围内都表现出促进细胞增殖.但是糖浓度增高至44mmol/L,细胞生长受到抑制(P<0.05),见图4.流式细胞周期分析结果见附表.11mmol/L糖浓度组PI值与对照组相当,25mmol/L组和16.5mmol/L组PI值高于对照组(P<0.05),44mmol/L组PI则低于对照组(P<0.05).2.5不同糖浓度对ALP活性的影响细胞培养4.7d,随着培养液糖浓度的升高,ALP活性降低(P<0.05),并与糖浓度组呈剂量依赖性(P<0.05)(图5).2.6不同糖浓度对Runx2.OsterixmRNA表达的影响成骨诱导3.7.14及21d,RT-PCR检测结果(图6.图7)显示：在相同时点,对照组Runx2.OsterixmRNA表达量高于实验组(P<0.05)；在整个成骨诱导过程中,各组Runx2.OsterixmRNA表达量均出现先上调再下调趋势,其中21d时,对照组Runx2.OsterixmRNA表达量分别是1L糖浓度的4.6倍和6.1倍(图6.图7).3讨论MSCs具有多向分化潜能以及自我更新能1[7].有学者研究发现[6],OFMSCs较髂骨MSCs成骨分化能力更强.颌骨与长骨的来源不一,是由机体骨骼系统中不同的细胞形成发育的[8],颌骨是由外胚层神经嵴细胞发育形成的[6],而长骨则是由中胚层的间叶细胞发育形成的[9].本研究中通过贴壁法与差速离心法获取OFMSCs,通过成骨.成脂及成软骨诱导鉴定OFMSCs具有成骨及成脂分化能力.本实验选取的糖浓度主要是参考人体的血糖水平,5.5mmol/L的糖浓度是细胞培养基中所含的基本糖浓度,同时也是正常健康人体内的血糖水平,25mmol/L的糖浓度模拟的是控制不良的糖尿病患者的血糖水平,而44mmol/L的糖浓度模拟的是严重糖尿病患者的血糖水平[10].本实验中采用CCK-8及流式细胞仪检测细胞增殖活性及增殖指数,结果较为一致.在5.5~25mmol/L的糖浓度范围内,随着糖浓度的增加,表现为促进细胞增殖,但糖浓度过高达44mmol/L,细胞生长受到明显抑制.可能是由于高糖环境在一定程度范围内为细胞生长提供能量[11],但是糖浓度过高,细胞无法抵抗高糖毒性或者是高糖伴随着的高渗毒性,细胞生长受到抑制.有学者[12]研究证明在15.5mmol/L的高糖环境中培养MC3T3细胞,可促进其增殖,但在15.5~35.5mmol/L范围内则抑制其增殖,并呈剂量依赖性.不同文献对高糖环境下细胞增殖活性的研究结果不一致,可能是由于选取的细胞种类不同,或选取的糖浓度不同,也有可能是相应的渗透压不一致等造成的影响.MSCs成骨分化过程中可分为三个阶段：第一阶段主要是细胞有丝分裂旺盛,生长活跃,是主要的增殖期；第二阶段主要是细胞外基质形成期,ALP活性增加.Runx2及OsterixmRNA表达活跃,增殖减慢；第三阶段主要是胞外基质矿化阶段,骨钙素和骨桥蛋白基因表达上调,ALP活性下降.Runx2及OsterixmRNA表达维持在一个较低水平.本研究结果发现,成骨诱导4d.7d,随着培养液糖浓度升高,ALP活性降低(P<0.05)；成骨诱导21d,随着培养液糖浓度的升高,钙结节形成.矿化定量减少；成骨诱导3.7.14及21d,同时点对照组Runx2.OsterixmRNA表达量高于实验组(P<0.05),在整个成骨诱导过程中各组Runx2.OsterixmRNA表达量均出现先上调再下调的趋势.说明糖浓度升高对成骨分化呈抑制效应,这与大部分的研究结果较为一致.有学者[13]研究证明高糖环境抑制MSCs成骨分化能力.但是也有部分研究发现[14],在5.5~11mmol/L糖浓度范围内,高糖促进MSCs成骨分化,ALP活性.钙结节形成数量都增加,随着糖浓度继续增加,ALP活性.钙结节形成数量显着下降；也有学者[14]发现高糖环境下成骨分化增强,但矿化质量不佳,Ca/P降低.在本实验中14d时,各组Runx2.OsterixmRNA表达量均达到最高峰,21d时,各组Runx2.OsterixmRNA表达量下调.这可能是由于成骨诱导时间延长,成骨效应累加,但在长期的高糖环境下培养,对OFMSCs成骨分化还是呈抑制作用.综上所述,本实验采用体外不同含糖量培养液模拟糖尿病不同血糖水平,探讨不同糖浓度对OFMSCs增殖及成骨分化的影响,研究结果表明长期的高糖环境,对OFMSCs成骨分化呈抑制作用.但是对于高糖环境如何影响增殖及成骨分化的具体机制及其从何种信号通路施加影响有待于进一步研究,以期为糖尿病引起的牙槽骨丧失提供理论依据以及寻求糖尿病条件下的口腔诊治提供策略.参考文献[1]PRESSMANAR,KINOSHITAL,KIRKS,etal.Anoveltelemonitoringdeviceforimprovingdiabetescontrol:protocolandresultsfromarandomizedclinicaltrial.TelemedJEHealth,2014,20(2)：109-114.[2]NEMTOIA,LADUNCAO,DRAGANE,etal.Quantitativeandqualitativeboneassessmentoftheposteriormandibleinpatientswithdiabetesmellitus:aconebeamcomputedtomographystudy.RevMedChirSocMedNatIasi,2013,117(4)：1002-1008.
种植技术的发展,种植牙是口腔缺失牙修复的重要方式,但糖尿病导致的骨骼并发症和异常代谢环境所致病理变化却极大降低了牙种植的成功率[4].糖尿病患者体内包含多种因素的改变,如血糖.相关激素及生长因子等,血糖的变化是比较直接的因素[5].现在大部分体外研究采用高糖培养基模拟糖尿病状态,研究高糖环境对骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,MSCs)的影响成为了目前关注的热点.有研究指出[6],颌骨骨髓间充质干细胞(orofacialbonemesenchymalstemcells,OFMSCs)与长骨MSCs不一样.鉴于目前的研究都集中于长骨MSCs而对OFMSCs的研究甚少,本实验在体外模拟不同糖浓度,观察评价不同糖浓度对大鼠OFMSCs增殖和成骨能力的影响,为进一步阐明糖尿病骨代谢障碍分子机制提供实验基础.1材料和方法1.1动物和主要试剂4周龄SD大鼠(由重庆医科大学提供),所有SD大鼠均根据中国重庆医科大学动物伦理委员会试验协议进行处置.胎牛血清(FBS).α-MEM培养基(Gibco,美国).葡萄糖.地塞米松.β-甘油磷酸钠.抗坏血酸(Sigma,美国).TrizolReagent(Invitrogen,美国),RT-PCR试剂盒(TaKaRa,日本).成脂诱导液(百思维,中国).0.25%胰酶.磷酸盐缓冲液.CCK-8试剂盒.碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒.茜素红染液等均为国产纯化级试剂.1.2OFMSCs的体外培养通过贴壁法与差速离心法获取OFMSCs.将4周龄雄性SD大鼠脱颈处死,体积分数75%乙醇浸泡3min,在超净工作台内取出下颌骨,仔细去除颌骨上附着的肌肉组织,暴露骨髓腔.5mL注射器吸取不含血清预冷的培养基反复冲洗骨髓腔,再按贴壁法培养OFMSCs.当OFMSCs生长到相互融合(约80%左右)传代培养,取第3代细胞进行实验.1.3OFMSCs成骨.成脂.成软骨诱导和鉴定成骨诱导鉴定：OFMSCs按每孔1×105的密度接种于6孔板中,细胞融合后(约80%左右)换成骨诱导液(α-MEM培养基中含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠.10-7mol/L地塞米松.50μg/mL抗坏血酸及10%FBS)培养,每2d换液,连续培养21d,再进行常规茜素红染色.成脂诱导鉴定：OFMSCs接种同上,换成脂诱导液培养,每2d换液,培养14d,再进行常规油红O染色.成软骨诱导鉴定：OFMSCs接种同上,换成软骨诱导液培养,每2d换液,培养14d,再进行常规阿利新蓝染色.1.4定量检测不同糖浓度对茜素红染色和矿化基质的影响实验分组为使用不同含糖量培养基(5.5.11.16.5.25.44mmol/L)培养OFMSCs,以5.5mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组.OFMSCs按每孔1×105的密度接种于6孔板,24h后更换不同含糖量的培养基,21d茜素红染色,光镜下观察钙结节.再于每孔中加入1mL抽提液(2%乙酸溶液与无水乙醇之比为8∶2)30min,避光,将每孔溶液分装到96孔板中,100μL/孔,于490nm波长下记录各孔吸光度(A)值.1.5检测不同糖浓度对细胞增殖的影响CCK-8法：OFMSCs按每孔1×103的密度接种于96孔板,细胞完全贴壁后用不含血清的培养基饥饿处理24h后更换不同含糖量的培养基.每孔中加入10μLCCK-8试剂,37℃孵箱3.5h,于450nm波长下测定A值,每组每天测3孔,连续测6d,绘制细胞增殖曲线.流式细胞术：OFMSCs饥饿处理后,采用不同糖浓度培养基常规培养4d,消化后制成细胞悬液2×106/mL,加入体积分数70%的预冷乙醇1.5mL,40℃过夜,离心后弃乙醇,PBS清洗2遍,最后加入碘化丙锭1mL,避光染色30min,流式细胞仪上机检测细胞DNA含量.进行细胞周期分析,计算增殖指数(proliferationindex,PI).1.6检测不同糖浓度对ALP活性的影响OFMSCs按每孔2×104的密度接种于24孔板,24h后更换不同含糖浓度的成骨诱导液,4.7d收集细胞.每管中加50μL0.2%TritonX-100,4℃过夜,裂解细胞.按试剂盒说明相应加入1液.2液和3液,充分混匀,立即接种于96孔板中,每组设置3个复孔,于波长520nm测定A值.1.7RT-PCR检测不同糖浓度对Runx2.OsterixmRNA表达的影响根据NCBI中大鼠β-actin.Runx2.Osterix基因序列,由金斯瑞生物科技有限公司进行引物设计及质量检测.引物序列如下.Runx2上游引物序列：5′-CCGAGACCAACCGAGTCATTTA-3′,下游引物序列：5′-AAGAGGCTGTTTGACGCCAT-3′；Osterix上游引物序列：5′-GCCAGTAATCTTCGTGCCAG-3′,下游引物序列：5′-TAGTGAGCTTCTTCCTGGGGA-3′；β-actin上游引物序列：5′-CCCGCGAGTACAACCTTCTTG-3′,下游引物序列：5′-GTCATCCATGGCGAACTGGTG-3′.培养OFMSCs24h后更换不同含糖浓度的成骨诱导液,诱导3.7.14及21d用TRIzol提取细胞RNA,用TaKaRa逆转录试剂盒逆转录RNA为稳定的cDNA,以cDNA为模板,用SYBRGreen法实时荧光定量检测PCR.采用β-actin为参照,ΔCt相对定量分析,样本平均相对含量倍数为2-ΔΔCt.1.8统计学方法实验数据以珚x±s表示.采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1OFMSCs细胞形态培养第3代的OFMSCs呈明显的漩涡状”生长(图1).2.2OFMSCs成骨.成脂.成软骨分化能力的鉴定OFMSCs成骨诱导21d后茜素红染色可见明显的钙结节(图2A)；成脂诱导14d后油红O染色可见红色脂滴(图2B)；成软骨诱导14d后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆(图2C).2.3茜素红染色及其定量分析成骨诱导21d,茜素红染色(图3)显示,随着培养液糖浓度的升高,钙结节形成减少.矿化定量分析观察,对照组(5.5mmol/L糖浓度)的A值(2.735±0.480)高于实验组(11.16.5.25.44mmol/L糖浓度的A值分别为1.613±0.219.1.165±0.220.0.811±0.019.0.611±0.006),P均<0.05.2.4不同糖浓度对细胞增殖的影响第1天各组细胞生长缓慢,差异无统计学意义,从第2天开始细胞进入对数生长期,生长迅速.第2天至第6天,在5.5~25mmol/L糖浓度范围内都表现出促进细胞增殖.但是糖浓度增高至44mmol/L,细胞生长受到抑制(P<0.05),见图4.流式细胞周期分析结果见附表.11mmol/L糖浓度组PI值与对照组相当,25mmol/L组和16.5mmol/L组PI值高于对照组(P<0.05),44mmol/L组PI则低于对照组(P<0.05).2.5不同糖浓度对ALP活性的影响细胞培养4.7d,随着培养液糖浓度的升高,ALP活性降低(P<0.05),并与糖浓度组呈剂量依赖性(P<0.05)(图5).2.6不同糖浓度对Runx2.OsterixmRNA表达的影响成骨诱导3.7.14及21d,RT-PCR检测结果(图6.图7)显示：在相同时点,对照组Runx2.OsterixmRNA表达量高于实验组(P<0.05)；在整个成骨诱导过程中,各组Runx2.OsterixmRNA表达量均出现先上调再下调趋势,其中21d时,对照组Runx2.OsterixmRNA表达量分别是1L糖浓度的4.6倍和6.1倍(图6.图7).
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