矮牵牛pmads3，fbp6基因的分离与敲除
矮牵牛，作为研究花发育的模式植物，近几年关于其花发育相关的转录因子研究多不胜数，这些花发育转录因子主要集中于MADS-box家族。拟南芥中C类基因AG被研究发现它的缺失表达能够造成雄蕊的瓣化，以及花器官分生组织的无限增生，最终在植物花上表现出重瓣的表型。为探索矮牵牛中C类功能基因PMADS3和FBP6在诱发重瓣花花型方面的重要作用，以实验室内保存的红花矮牵牛作为材料，对两种基因进行基因分离，应用CRISPR-Cas9系统成功进行基因敲除。关键字 矮牵牛，PMADS3，FBP6，基因分离，基因敲除，CRISPR-Cas9目 录
1 引言 1
1.1 ABC模型 1
1.2 重瓣花的起源类型 2
1.3 花分生组织特性是维持和终止 3
1.4 CRISPR-Cas9系统 4
1.5 研究目的 4
2 材料与方法（基因分离） 5
2.1 实验材料 5
2.1.1 植物材料 5
2.1.2 菌株和质粒 5
2.1.3 酶和生化试剂 5
2.2 实验方法 5
2.2.1 Trizol法提取总RNA 5
2.2.2 目的基因的分离 6
2.2.2.1 反转录 cDNA 第一链的合成 6
2.2.2.2 纯化及加尾 6
2.2.2.3 中间片段的获得 6
2.2.2.4 3′ RACE PCR和5′ RACE PCR 7
2.2.2.5 全长目的基因扩增 7
2.2.2.6 连接转化 7
2.2.2.7 序列测定和分析 8
3 材料与方法（基因敲除） 8
3.1 实验材料 8
3.1.1 植物材料 8
3.1.2 菌株与质粒 8
3.1.3 酶和生化试剂 8
3.2 实验方法 9
3.2.1 矮牵牛愈伤组织培养 9
3.2.1.1 无菌苗的获得 9
3.2.1.2 培养条件 9
3.2.1.3
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
因敲除） 8
3.1 实验材料 8
3.1.1 植物材料 8
3.1.2 菌株与质粒 8
3.1.3 酶和生化试剂 8
3.2 实验方法 9
3.2.1 矮牵牛愈伤组织培养 9
3.2.1.1 无菌苗的获得 9
3.2.1.2 培养条件 9
3.2.1.3 愈伤组织诱导 9
3.2.2 载体构建 9
3.2.2.1 表达载体构建 9
3.2.3 农杆菌转化 14
3.2.3.1 愈伤组织侵染步骤 14
3.2.3.2 抗生素对愈伤组织生长的抑制作用 15
3.2.4 转基因植株基因敲除检测 15
3.2.4.1 矮牵牛基因组DNA提取 15
3.2.4.2 敲除基因检测 16
3.2.4.3 目的片段连接测序 16
4 结果与分析 17
4.1 PMADS3和FBP6基因片段分离 17
4.2 叶片诱导愈伤组织 18
4.3 敲除矮牵牛AG类基因载体构建 19
4.3 农杆菌介导的遗传转化条件 21
4.3.1 抗生素筛选浓度的确定 21
4.3.2 预培养时间对转化效率的影响 22
4.3.3 农杆菌菌液浓度及侵染时间对转化效率的影响 23
4.3.4 共培养时间对遗传转化效率的影响 24
4.4 基因敲除突变体 24
4.4.1 基因敲除突变体的检测 24
5 讨论 25
5.1 基因敲除遗传转化的条件 25
结 论 26
致 谢 27
参 考 文 献 28
1 引言
矮牵牛（Petunia hybrida）为茄科一种一年生草本花卉，由于其有较短的生长周期，且染色体数目较少而成为研究植物花发育器官的模式材料之一。植物花发育是研究植物发育及其遗传调控方面的重要方向，已获得重大的理论突破，主要有ABC模型的建立、花分生组织特征基因LFY的发现、开花素（FT）的发现等。因此，花发育的研究具有理论上的价值。
矮牵牛也是世界广泛栽培的著名花坛花卉之一。矮牵牛以花冠大、花色丰富、自然花期长著称。
花型是花卉重要的观赏性状。重瓣花类型是花型观赏的主要方面。对花卉而言，重瓣花品种观赏价值更高。
1.1 ABC模型
通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana)、金鱼草(Antirrhinum majus)和矮牵牛(花同源器官转化突变体的研究揭示出花器官发育的内在机制，提出了ABC模型[1]。不把胚珠看作一轮花器官，并把在改进后的模型中，控制花器官特征基因被划分为3种功能类型：A类功能基因(AP1和AP2)单独表达确定花萼发生；A、B（AP3/PI）共同确定花瓣；B、C（AG）类功能决定雄蕊；C类功能单独作用调控心皮发育[2]。除了AP2外，其他基因均编码MADS盒转录因子。
从花发育模型可以分析出：花瓣发育由A、B和E类基因调控，但重瓣花则是由C类功能基因的表达变化诱发的。因此，AG类基因突变是重瓣花发生的遗传基础之一[3]。
矮牵牛C类有PMADS3?和FBP6两个成员，它们的表达模式、基因沉默植株的形态表型和编码蛋白互作都与AG相同。
图1 花器官发育的ABC模型图
1.2 重瓣花的起源类型
不同的植物，花瓣轮数和花瓣数目是固定的，但是也有众多的植物种类或类型，出现了花瓣轮数和数目增加，即重瓣现象。起源方式主要有三种：自然增加、器官瓣化和花中花。
自然增加类型可积累增加，即离瓣花经过人工选择，花瓣数梯度增加，如考石竹（Linanthus androsaceus），也可重复，即增加花瓣轮是原有花瓣轮模式的复制，如草原龙胆（Eustoma grandiflorum）。
雄蕊、雌蕊瓣化是多数植物重瓣花的花瓣来源。在牡丹（Paeonia suffruticosa）高级花型中，除原有花瓣外，可以观察到雄瓣化蕊和、心皮瓣化和自然增加花瓣。雄蕊离心瓣化形成“楼子类”花型；而向心瓣化形成“千层类”花型，而自然增加不能形成高级花型。山茶花（Camellia japonica）B类功能基因CjDEF-1在萼片和花苞片中表达，认为它们是花瓣的起源之一。
台阁型重瓣花则是花轴极度缩短的花中花。
C类基因和花分生组织特征基因WUS之间的反馈调控环的打破是重瓣花发育的基本机制。拟南芥ag突变体，雄蕊和
1 引言 1
1.1 ABC模型 1
1.2 重瓣花的起源类型 2
1.3 花分生组织特性是维持和终止 3
1.4 CRISPR-Cas9系统 4
1.5 研究目的 4
2 材料与方法（基因分离） 5
2.1 实验材料 5
2.1.1 植物材料 5
2.1.2 菌株和质粒 5
2.1.3 酶和生化试剂 5
2.2 实验方法 5
2.2.1 Trizol法提取总RNA 5
2.2.2 目的基因的分离 6
2.2.2.1 反转录 cDNA 第一链的合成 6
2.2.2.2 纯化及加尾 6
2.2.2.3 中间片段的获得 6
2.2.2.4 3′ RACE PCR和5′ RACE PCR 7
2.2.2.5 全长目的基因扩增 7
2.2.2.6 连接转化 7
2.2.2.7 序列测定和分析 8
3 材料与方法（基因敲除） 8
3.1 实验材料 8
3.1.1 植物材料 8
3.1.2 菌株与质粒 8
3.1.3 酶和生化试剂 8
3.2 实验方法 9
3.2.1 矮牵牛愈伤组织培养 9
3.2.1.1 无菌苗的获得 9
3.2.1.2 培养条件 9
3.2.1.3
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
因敲除） 8
3.1 实验材料 8
3.1.1 植物材料 8
3.1.2 菌株与质粒 8
3.1.3 酶和生化试剂 8
3.2 实验方法 9
3.2.1 矮牵牛愈伤组织培养 9
3.2.1.1 无菌苗的获得 9
3.2.1.2 培养条件 9
3.2.1.3 愈伤组织诱导 9
3.2.2 载体构建 9
3.2.2.1 表达载体构建 9
3.2.3 农杆菌转化 14
3.2.3.1 愈伤组织侵染步骤 14
3.2.3.2 抗生素对愈伤组织生长的抑制作用 15
3.2.4 转基因植株基因敲除检测 15
3.2.4.1 矮牵牛基因组DNA提取 15
3.2.4.2 敲除基因检测 16
3.2.4.3 目的片段连接测序 16
4 结果与分析 17
4.1 PMADS3和FBP6基因片段分离 17
4.2 叶片诱导愈伤组织 18
4.3 敲除矮牵牛AG类基因载体构建 19
4.3 农杆菌介导的遗传转化条件 21
4.3.1 抗生素筛选浓度的确定 21
4.3.2 预培养时间对转化效率的影响 22
4.3.3 农杆菌菌液浓度及侵染时间对转化效率的影响 23
4.3.4 共培养时间对遗传转化效率的影响 24
4.4 基因敲除突变体 24
4.4.1 基因敲除突变体的检测 24
5 讨论 25
5.1 基因敲除遗传转化的条件 25
结 论 26
致 谢 27
参 考 文 献 28
1 引言
矮牵牛（Petunia hybrida）为茄科一种一年生草本花卉，由于其有较短的生长周期，且染色体数目较少而成为研究植物花发育器官的模式材料之一。植物花发育是研究植物发育及其遗传调控方面的重要方向，已获得重大的理论突破，主要有ABC模型的建立、花分生组织特征基因LFY的发现、开花素（FT）的发现等。因此，花发育的研究具有理论上的价值。
矮牵牛也是世界广泛栽培的著名花坛花卉之一。矮牵牛以花冠大、花色丰富、自然花期长著称。
花型是花卉重要的观赏性状。重瓣花类型是花型观赏的主要方面。对花卉而言，重瓣花品种观赏价值更高。
1.1 ABC模型
通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana)、金鱼草(Antirrhinum majus)和矮牵牛(花同源器官转化突变体的研究揭示出花器官发育的内在机制，提出了ABC模型[1]。不把胚珠看作一轮花器官，并把在改进后的模型中，控制花器官特征基因被划分为3种功能类型：A类功能基因(AP1和AP2)单独表达确定花萼发生；A、B（AP3/PI）共同确定花瓣；B、C（AG）类功能决定雄蕊；C类功能单独作用调控心皮发育[2]。除了AP2外，其他基因均编码MADS盒转录因子。
从花发育模型可以分析出：花瓣发育由A、B和E类基因调控，但重瓣花则是由C类功能基因的表达变化诱发的。因此，AG类基因突变是重瓣花发生的遗传基础之一[3]。
矮牵牛C类有PMADS3?和FBP6两个成员，它们的表达模式、基因沉默植株的形态表型和编码蛋白互作都与AG相同。
图1 花器官发育的ABC模型图
1.2 重瓣花的起源类型
不同的植物，花瓣轮数和花瓣数目是固定的，但是也有众多的植物种类或类型，出现了花瓣轮数和数目增加，即重瓣现象。起源方式主要有三种：自然增加、器官瓣化和花中花。
自然增加类型可积累增加，即离瓣花经过人工选择，花瓣数梯度增加，如考石竹（Linanthus androsaceus），也可重复，即增加花瓣轮是原有花瓣轮模式的复制，如草原龙胆（Eustoma grandiflorum）。
雄蕊、雌蕊瓣化是多数植物重瓣花的花瓣来源。在牡丹（Paeonia suffruticosa）高级花型中，除原有花瓣外，可以观察到雄瓣化蕊和、心皮瓣化和自然增加花瓣。雄蕊离心瓣化形成“楼子类”花型；而向心瓣化形成“千层类”花型，而自然增加不能形成高级花型。山茶花（Camellia japonica）B类功能基因CjDEF-1在萼片和花苞片中表达，认为它们是花瓣的起源之一。
台阁型重瓣花则是花轴极度缩短的花中花。
C类基因和花分生组织特征基因WUS之间的反馈调控环的打破是重瓣花发育的基本机制。拟南芥ag突变体，雄蕊和
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