医用钛材抗凝血及促内皮细胞生长表面改性研究
医用钛材抗凝血及促内皮细胞生长表面改性研究
本文通过顺序接枝聚乙二醇（PEG）和胶原蛋白，同时提高钛材的抗凝血性能和促内皮细胞增殖性能。经衰减全反射傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析确认在钛表面成功的接枝了聚乙二醇和胶原蛋白，通过水解触角的测量证实钛具备了一个良好的亲水性表面。抗凝血试验证明接枝PEG和随后的接枝胶原蛋白可以降低血小板粘附和活化。在Ti-PEG表面接枝胶原蛋白可以在某种程度上提高血液相容性。同时，相对于Ti和Ti-PEG的表面，接枝过胶原蛋白的Ti-PEG的表面能明显提高内皮细胞的增殖，这表明改性后的钛材可促内皮细胞化而又不降低血液相容性。本文的研究可以用于对血液接触性医用生物材料的表面改性，同时赋予材料优良的血液相容性和促细胞生长性能，可望在血管内植入器械（如，血管支架）的表面改性方面获得应用。
关键词 钛，抗凝血，聚乙二醇，内皮细胞，胶原蛋白
1 绪论 1
1.1 问题的提出 1
1.2 血液凝固的机理及材料的血液相容性 1
1.3 医用钛合金的表面改性技术 2
1.4 本课题的研究目的与意义 5
1.5 本论文的研究内容与技术路线 5
2 实验 6
2.1 材料与方法 6
2.2 样品清洗 7
2.3 钛表面接枝聚乙二醇二羧酸（PEG） 7
2.4 Ti-PEG表面接枝胶原蛋白（COL） 8
2.5 材料表面表征 9
2.6 血小板黏附实验 10
2.7 细胞增殖实验 10
3 结果与讨论 11
3.1 材料表面水接触角分析 11
3.2 ATR-FTIR分析 12
3.3 血小板粘附分析 13
3.4 细胞活性与增殖 14
结论 16
致谢 17
参考文献18
1 绪论
1.1 问题的提出
近年来，患有心血管疾病的人越来越多，在我国，死于心血管疾病的人也不断增加，据统计，每年将近有30万人因心血管疾病死亡，心血管疾病已经成为威胁人类健康的第一杀手。心血管植入器械是治疗这些疾病的有效方法，而由于生物医用钛材具有优良的机械性能和抗腐蚀性能，被广泛用来制备血液接触医疗器械，例如，人工心脏瓣膜、左心室辅助装置、血管支架等[1,2]。虽然钛材生物材料具有良好的生物学性能，但是钛表面的血液相容性不足，而且促内皮细胞生长的能力有限，所以常会导致血栓形成而致使植入失败。
当材料植入人体血管后，材料与血液以及周围组织之间的界面相互作用，对材料的生物学性能和功能具有决定性作用，因此，通过对材料表面改性是提高材料表面的抗凝血性以及促内皮细胞生长的有效方法[3-5]。然而，在许多情况下，经过抗凝血表面改性的材料表面，并不能有效促进内皮细胞的生长，如，广泛采用的抗凝血分子聚乙二醇与肝素以及磷脂胆碱分子，都具有组织内皮细胞粘附的作用，与此同时，一些能够提供细胞生长位点的细胞外基质蛋白（如，纤连蛋白，一种广泛采用的细胞外基质蛋白）也具有引发血栓形成的作用。可见，同时使材料表面具有抗凝血与促内皮细胞生长性能是目前心血管植入器械的研究难点。本课题将基于自组装技术以及原位化学反应技术在材料表面顺序固定抗凝血分子和促细胞生长分子，期望同时赋予材料良好的抗凝血性能以及促内皮细胞生长性能。
1.2 血液凝固的机理及材料的血液相容性
1.2.1 血液凝固的机理
血液凝固是一个非常繁杂的化学反应过程，其本质就是纤维蛋白由溶胶状态转变为凝胶状态。血液与材料接触后形成血栓的主要途径是血液凝固系统与细胞系统产生激活，而且也与补体系统的变化、材料类别以及血液状况有关。
血液与材料相接触后，会发生一连串的反应：血液中的蛋白质与脂类迅速的吸附在材料表面，然后血小板便很快的在材料表面吸附，并且血小板会聚集和激活，凝血系统同时也会被激活，血小板和凝血系统互相作用，从而形成血栓[6]。由触发凝血过程的方式又可以把凝血分为内源性凝血和外源性凝血凝血两种。首先，Ca2+介入凝血酶原激活物后，使凝血酶原转变成具有活性的凝血酶，然后凝血酶对纤维蛋白原作用，形成丝状纤维蛋白，然后网罗白细胞，并析出血清，从而形成血栓[7]。
图1-1所示的是血液与材料接触所引发的凝血过程：
图1-1 血液与生物材料接触所引发的凝血过程
1.2.2 生物材料的血液相容性
生物材料的血液相容性就是材料和血液相接触之后，不会致使血浆蛋白发生变性，不会破坏血液的有效成分，不会致使血液凝固以及血栓形成，不会改变血液的生理环境，不会带来有害的免疫反应等问题的一种性能。血液相容性是生物材料最重要的一种性能，抗凝血性能的好坏是生物材料可否被利用的决定性因素[8,9]。材料血液相容性的影响因素主要有：材料表面的粗糙度、材料与血液之间的界面自由能、材料表面的亲疏水性、材料表面的化学结构与官能团等的物理以及化学性质。提高材料的血液相容性可以通过以上途径来处理。
1.3 医用钛合金的表面改性技术
医用钛合金生物材料的力学性能和生物相容性虽然良好，但当植入体内之后，不仅难于与生物组织牢固结合，而且钛合金中某些成分还会引起致敏、致癌、致突变等问题，所以需通过对钛材表面改性来改善它的血液相容性，延长材料的使用寿命。根据材料与血液接触后而导致血栓形成的生物学反应，可以通过以下几个方面来改善材料的血液相容性：阻碍血小板体系的活化、降低凝固体系活化性能、增进血栓的溶解，根据这些原则，可采用的表面改性方式有：亲疏水性表面改性、材料表面负载电荷、材料表面生物化[10-12]。形成这些表面性能的主要技术有等离子体技术、层层静电自组装、化学键固定等。通过这些技术对材料表面进行处理之后，材料表面的血液相容性会得到显著提高。
1.3.1 等离子体技术
等离子体技术是利用非聚合物性的气体（例如Ar、N2、H2、O2等）的辉光放电等离子体对材料进行表面改性的的一种表面改性技术。等离子体技术包括等离子体处理、等离子体聚合和等离子体引发接枝聚合。经过等离子技术处理后的材料表面会引入某些特定的活性官能团，从而赋予材料表面各种性能[13]，例如等离子体表面处理后的材料表面会产生大量的羟基；等离子体聚合接枝会使材料表面附着特定的活性官能团，并且材料经过等离子体处理后，产生的活化基团可以进一步和其他功能性的分子结合，从而可把大分子的有机物质接枝到材料的表面，使材料表面的生物活性更加优良，具备特定的性能[14]。
黄楠等人对这一技术有深入的研究，他们通过等离子体离子浸没注入及沉积技术与非平衡磁控溅射技术将TiO2沉积在钛表面，从而使钛材表面的血液相容性得到提高[15]，并且TiO2经氢等离子处理后，显著地改善了它的血液相容性。等离子体离子浸没注入技术在医疗植入器械表面的应用，可更容易获得均匀的活化层，尤其对于那些表面形状不规则的材料。
陈亚芍[16]经等离子体化学气相沉积法以及液相阴极等离子体渗碳氮技术使钛表面得到沉积DLC膜，实验表明等离子体处理提高了材料表面的抗凝血性，然后利用紫外辐照和硅烷偶联的方法在沉积了DLC膜的材料表面接枝PEG，进一步改善了材料表面的抗凝血性。
1.3.2 层层静电自组装
层层自组装技术（LBL）是通过逐层交替沉积的方法，借助各层分子间的弱相互作用（如静电引力、氢键、配位键等），使层和层自发地缔合构成结构完整、性能稳定、具备某种特定功能的分子聚集体或者超分子结构的过程。与化学固定相比，LBL对化学键的要求很低，此方法的特点是在聚阴离子与聚阳离子的整个吸附过程中都存在着，所以最外一层会呈电性。
Cai[17]等利用LBL在钛合金表面自组装明胶后，显著地改善了材料表面的生物相容性，而且使材料表面所粘附的细胞的毒性降低。Brunot等人[18]在钛合金表面自组装PSS/PAH，研究表明显著提高了材料的血液相容性。
本文通过顺序接枝聚乙二醇（PEG）和胶原蛋白，同时提高钛材的抗凝血性能和促内皮细胞增殖性能。经衰减全反射傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析确认在钛表面成功的接枝了聚乙二醇和胶原蛋白，通过水解触角的测量证实钛具备了一个良好的亲水性表面。抗凝血试验证明接枝PEG和随后的接枝胶原蛋白可以降低血小板粘附和活化。在Ti-PEG表面接枝胶原蛋白可以在某种程度上提高血液相容性。同时，相对于Ti和Ti-PEG的表面，接枝过胶原蛋白的Ti-PEG的表面能明显提高内皮细胞的增殖，这表明改性后的钛材可促内皮细胞化而又不降低血液相容性。本文的研究可以用于对血液接触性医用生物材料的表面改性，同时赋予材料优良的血液相容性和促细胞生长性能，可望在血管内植入器械（如，血管支架）的表面改性方面获得应用。
关键词 钛，抗凝血，聚乙二醇，内皮细胞，胶原蛋白
1 绪论 1
1.1 问题的提出 1
1.2 血液凝固的机理及材料的血液相容性 1
1.3 医用钛合金的表面改性技术 2
1.4 本课题的研究目的与意义 5
1.5 本论文的研究内容与技术路线 5
2 实验 6
2.1 材料与方法 6
2.2 样品清洗 7
2.3 钛表面接枝聚乙二醇二羧酸（PEG） 7
2.4 Ti-PEG表面接枝胶原蛋白（COL） 8
2.5 材料表面表征 9
2.6 血小板黏附实验 10
2.7 细胞增殖实验 10
3 结果与讨论 11
3.1 材料表面水接触角分析 11
3.2 ATR-FTIR分析 12
3.3 血小板粘附分析 13
3.4 细胞活性与增殖 14
结论 16
致谢 17
参考文献18
1 绪论
1.1 问题的提出
近年来，患有心血管疾病的人越来越多，在我国，死于心血管疾病的人也不断增加，据统计，每年将近有30万人因心血管疾病死亡，心血管疾病已经成为威胁人类健康的第一杀手。心血管植入器械是治疗这些疾病的有效方法，而由于生物医用钛材具有优良的机械性能和抗腐蚀性能，被广泛用来制备血液接触医疗器械，例如，人工心脏瓣膜、左心室辅助装置、血管支架等[1,2]。虽然钛材生物材料具有良好的生物学性能，但是钛表面的血液相容性不足，而且促内皮细胞生长的能力有限，所以常会导致血栓形成而致使植入失败。
当材料植入人体血管后，材料与血液以及周围组织之间的界面相互作用，对材料的生物学性能和功能具有决定性作用，因此，通过对材料表面改性是提高材料表面的抗凝血性以及促内皮细胞生长的有效方法[3-5]。然而，在许多情况下，经过抗凝血表面改性的材料表面，并不能有效促进内皮细胞的生长，如，广泛采用的抗凝血分子聚乙二醇与肝素以及磷脂胆碱分子，都具有组织内皮细胞粘附的作用，与此同时，一些能够提供细胞生长位点的细胞外基质蛋白（如，纤连蛋白，一种广泛采用的细胞外基质蛋白）也具有引发血栓形成的作用。可见，同时使材料表面具有抗凝血与促内皮细胞生长性能是目前心血管植入器械的研究难点。本课题将基于自组装技术以及原位化学反应技术在材料表面顺序固定抗凝血分子和促细胞生长分子，期望同时赋予材料良好的抗凝血性能以及促内皮细胞生长性能。
1.2 血液凝固的机理及材料的血液相容性
1.2.1 血液凝固的机理
血液凝固是一个非常繁杂的化学反应过程，其本质就是纤维蛋白由溶胶状态转变为凝胶状态。血液与材料接触后形成血栓的主要途径是血液凝固系统与细胞系统产生激活，而且也与补体系统的变化、材料类别以及血液状况有关。
血液与材料相接触后，会发生一连串的反应：血液中的蛋白质与脂类迅速的吸附在材料表面，然后血小板便很快的在材料表面吸附，并且血小板会聚集和激活，凝血系统同时也会被激活，血小板和凝血系统互相作用，从而形成血栓[6]。由触发凝血过程的方式又可以把凝血分为内源性凝血和外源性凝血凝血两种。首先，Ca2+介入凝血酶原激活物后，使凝血酶原转变成具有活性的凝血酶，然后凝血酶对纤维蛋白原作用，形成丝状纤维蛋白，然后网罗白细胞，并析出血清，从而形成血栓[7]。
图1-1所示的是血液与材料接触所引发的凝血过程：
图1-1 血液与生物材料接触所引发的凝血过程
1.2.2 生物材料的血液相容性
生物材料的血液相容性就是材料和血液相接触之后，不会致使血浆蛋白发生变性，不会破坏血液的有效成分，不会致使血液凝固以及血栓形成，不会改变血液的生理环境，不会带来有害的免疫反应等问题的一种性能。血液相容性是生物材料最重要的一种性能，抗凝血性能的好坏是生物材料可否被利用的决定性因素[8,9]。材料血液相容性的影响因素主要有：材料表面的粗糙度、材料与血液之间的界面自由能、材料表面的亲疏水性、材料表面的化学结构与官能团等的物理以及化学性质。提高材料的血液相容性可以通过以上途径来处理。
1.3 医用钛合金的表面改性技术
医用钛合金生物材料的力学性能和生物相容性虽然良好，但当植入体内之后，不仅难于与生物组织牢固结合，而且钛合金中某些成分还会引起致敏、致癌、致突变等问题，所以需通过对钛材表面改性来改善它的血液相容性，延长材料的使用寿命。根据材料与血液接触后而导致血栓形成的生物学反应，可以通过以下几个方面来改善材料的血液相容性：阻碍血小板体系的活化、降低凝固体系活化性能、增进血栓的溶解，根据这些原则，可采用的表面改性方式有：亲疏水性表面改性、材料表面负载电荷、材料表面生物化[10-12]。形成这些表面性能的主要技术有等离子体技术、层层静电自组装、化学键固定等。通过这些技术对材料表面进行处理之后，材料表面的血液相容性会得到显著提高。
1.3.1 等离子体技术
等离子体技术是利用非聚合物性的气体（例如Ar、N2、H2、O2等）的辉光放电等离子体对材料进行表面改性的的一种表面改性技术。等离子体技术包括等离子体处理、等离子体聚合和等离子体引发接枝聚合。经过等离子技术处理后的材料表面会引入某些特定的活性官能团，从而赋予材料表面各种性能[13]，例如等离子体表面处理后的材料表面会产生大量的羟基；等离子体聚合接枝会使材料表面附着特定的活性官能团，并且材料经过等离子体处理后，产生的活化基团可以进一步和其他功能性的分子结合，从而可把大分子的有机物质接枝到材料的表面，使材料表面的生物活性更加优良，具备特定的性能[14]。
黄楠等人对这一技术有深入的研究，他们通过等离子体离子浸没注入及沉积技术与非平衡磁控溅射技术将TiO2沉积在钛表面，从而使钛材表面的血液相容性得到提高[15]，并且TiO2经氢等离子处理后，显著地改善了它的血液相容性。等离子体离子浸没注入技术在医疗植入器械表面的应用，可更容易获得均匀的活化层，尤其对于那些表面形状不规则的材料。
陈亚芍[16]经等离子体化学气相沉积法以及液相阴极等离子体渗碳氮技术使钛表面得到沉积DLC膜，实验表明等离子体处理提高了材料表面的抗凝血性，然后利用紫外辐照和硅烷偶联的方法在沉积了DLC膜的材料表面接枝PEG，进一步改善了材料表面的抗凝血性。
1.3.2 层层静电自组装
层层自组装技术（LBL）是通过逐层交替沉积的方法，借助各层分子间的弱相互作用（如静电引力、氢键、配位键等），使层和层自发地缔合构成结构完整、性能稳定、具备某种特定功能的分子聚集体或者超分子结构的过程。与化学固定相比，LBL对化学键的要求很低，此方法的特点是在聚阴离子与聚阳离子的整个吸附过程中都存在着，所以最外一层会呈电性。
Cai[17]等利用LBL在钛合金表面自组装明胶后，显著地改善了材料表面的生物相容性，而且使材料表面所粘附的细胞的毒性降低。Brunot等人[18]在钛合金表面自组装PSS/PAH，研究表明显著提高了材料的血液相容性。
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