生物材料表面生物活性微图形对内皮细胞生长行为及血液行为的影响
钛基材料近年来成为医用材料的研究热点，作为心血管植入材料和矫形外科材料有着广泛的应用前景。但是它与人体组织仍然存在着性能和结构上的差异，不能够完全替代人体组织的功能。为了提高钛的生物相容性，常常通过表面改性的方法，来改善钛的表面结构和性能。本文采用微接触印刷术，在医用钛材表面制备纤连蛋白和肝素两种生物分子及不同尺寸的微图形。通过红外光谱、水接触角、细胞和血液粘附实验等表征方法，进一步研究了这些微图形对内皮细胞生长行为和血小板粘附行为的影响。结果表明，细胞优先在微图形区域生长，且随着时间增长，细胞增殖和粘附增多；通过控制微图形尺寸的变化，可以有效地调控细胞生长及血液的粘附行为；微图形尺寸相同的情况下，接枝不同的生物分子，细胞和血小板在样品表面的生长和粘附行为有所不同。关键词 医用钛材，微图形，内皮细胞，血小板目 录
1 绪论 1
1.1 问题的提出 1
1.2 医用钛材的性质和应用 1
1.3 生物相容性 1
1.4 微图形对内皮细胞生长及血液行为的调控 2
1.5 微接触印刷术 3
1.6 接枝生物分子的性质 4
1.7 本课题的目的和意义 5
1.8 本课题的研究内容及技术路线 5
2 实验 6
2.1 样品、试剂及仪器 6
2.2 实验过程 7
2.3 表面结构的表征 9
3 实验结果与分析 10
3.1 ATR-FTIR分析 10
3.2 表面接触角分析 11
3.3 生物活性微图形对细胞粘附行为的影响 12
3.4 血小板粘附性能分析 14
结论 17
致谢 18
参考文献 19
1 绪论
1.1 问题的提出
生物材料是一种用于诊断和修复人体组织的天然或人造的材料[1,2]，随着社会的发展，它被广泛的运用于临床医学，并且已经取得了良好的效果。医用钛材作为生物医用金属材料的一种，凭借其良好的物化性质,逐渐成为应用广泛的植入材料。通过表面改性的方法,改变钛材表面的结构或性能,可以显著提高 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
致谢 18
参考文献 19
1 绪论
1.1 问题的提出
生物材料是一种用于诊断和修复人体组织的天然或人造的材料[1,2]，随着社会的发展，它被广泛的运用于临床医学，并且已经取得了良好的效果。医用钛材作为生物医用金属材料的一种，凭借其良好的物化性质,逐渐成为应用广泛的植入材料。通过表面改性的方法,改变钛材表面的结构或性能,可以显著提高钛材的生物相容性。
研究表明，材料表面的生物相容性不仅与材料表面的生物活性有关，也与材料表面的特定拓扑结构有关。近年来发展的微图形技术可以对材料表面的化学组成以及拓扑结构进行精确的设计，已经成为生物材料表面改性的重要技术手段。本课题采用微接触印刷术，在钛材的表面构建不同种类细胞外基质蛋白（纤连蛋白，纤连蛋白＋肝素）微图形。通过使用四种不同规格的印章，控制微图形的尺寸，以此来探索微图形对细胞和血液行为的影响规律。
1.2 医用钛材的性质和应用
生物材料应用广泛，一般依据组织和性质，将生物材料分为医用金属材料、高分子材料、无机材料三大类。钛属于医用金属材料，而且是一种同素异形体，与人体生理环境有着良好的反应。在自然条件或含氧的介质中，钛表面会很快结成一层致密的TiO2氧化膜，保护了钛基体不受腐蚀，即使遇到表面磨损或擦伤，氧化膜也可以再生。因此，氧化钛的高稳定性赋予其优异的耐生理腐蚀性能和良好的生物相容性，因此，钛及其合金材料在临床上常用做矫形外科材料和心血管植入材料，如，血管支架、血栓滤器、人工骨关节、膝关节、牙种植体等。
但是，钛作为一种金属材料，它与人体组织仍然存在着很多性能上的差异，并不能够完全替代人体组织和机构的功能。因此，人们常常通过表面改性技术[3]，来改善钛的表面结构和性能，如在钛表面接枝生物活性分子或在钛表面制备蛋白活性微图形[4-6]，来改善钛的生物活性。
1.3 生物相容性
生物相容性指生物医用材料植入人体以后与人体组织的相容程度，即生物材料可以被生物体或其组成单位接收或容纳的能力。生物相容性决定于植入材料的性质，当材料植入人体后，可能会造成体内细胞粘附和凝血等行为。因此，当材料作为医用植入材料时，要对其生物相容性做综合性的评价。一般来说，生物相容性包括细胞相容性和血液相容性两个方面。
细胞相容性指材料植入体内后，细胞在材料表面粘附与生长。一般来讲，研究细胞相容性的根本途径就是在材料表面种植和培养细胞，随着时间的推移，来观察细胞在材料表面的粘附生长情况，从而来判断此材料细胞相容性的好坏。类似的，血液相容性就是指材料与血液各成分之间的相容性，血液相容性较好的材料不会造成凝血和血栓[7]。它一般包含存活、粘附、增殖、分化几个方面，通过电镜观察血细胞与各种材料表面的附着情况，从血小板参与凝血的角度来判断该材料血液相容性的好坏。
1.4 微图形对内皮细胞生长及血液行为的调控
内皮细胞位于血液及血管组织之间，它能合成和分泌多种生物活性物质[8]，维持血管张力，防止血液凝固。在正常条件下，内皮细胞在体内沿血流方向规律性排列，这种形态和内皮的抗凝血性能密切相关。然而，目前内皮细胞在生物医用材料表面粘附的牢固程度和生长活性一直不能达到理想的效果，所以，进一步研究表面改性材料的表面结构，亲疏水性等性质对内皮细胞的影响是十分必要的。
在1911年，Harrison[9]就发现细胞可以对图形信号作出一定的反应。然而，微图形技术真正用于细胞研究始于上个世纪的70年代。郑楠[10]等利用光刻技术发现细胞在小于10um图形上的增殖大于无图形的钛表面,胡石琼[11]利用光刻技术制备的微图形试验，验证了微图形能够提高细胞与基体的粘附，Koh[12]等在表面制备柱状微图形,并研究了它对纤维蛋白原血小板粘附激活的影响,发现微图形可以降低纤维蛋白原的吸附和血小板的粘附。前人们所做的这些试验，都能够充分的说明，构建生物材料表面活性微图形，可以对细胞产生一定的调控作用[13]。
把生物活性分子采用微图形技术固定在医用钛材表面构建生物活性微图形，不仅可以调控细胞的形态和功能，还可以有望实现细胞的选择性生长和制备有序的高密度内皮细胞层[14]，从而制备出良好抗凝血性能的材料表面。研究表明，材料表面的微图形可以提高生物材料的生物相容性[15]，直接影响细胞的取向、黏附和形态，有效调控细胞的生长、蛋白表达等行为。除此以外，其表面分布的拓扑结构也会对血液及内皮细胞行为造成不同程度的影响[16]。因此，微图形逐渐成为材料表面改性的重要手段。目前，生物材料表面微图形化技术有很多种方法，其中包括激光光刻法、电化学法[17]等。然而，这些方法存在一些不足，比如激光光刻法在构建微图形的过程中容易带入杂质，直接影响内皮细胞的生长行为，电化学法相对于微接触印刷法也存在明显不足。
1.5 微接触印刷术
微接触印刷术[18]，简称uCP,被人们通俗的称呼为“蘸墨法”，它是在1993年由美国科学家Whitesides提出的[19]。它常用的材料是聚二甲基硅氧烷溶液PDMS，将PDMS浇在模板上，制作成为弹性印章。然后，用生物活性分子（纤连蛋白和肝素）溶液为“墨水”，用移液枪滴加至弹性印章表面，等到溶剂挥发后，将它印至基体材料表面。微接触印刷术比较适用于微米到纳米[20]级别精细图纹的印刷，最小甚至能够印几十纳米的图案，可用于超微器件的制备[21,22]。
1 绪论 1
1.1 问题的提出 1
1.2 医用钛材的性质和应用 1
1.3 生物相容性 1
1.4 微图形对内皮细胞生长及血液行为的调控 2
1.5 微接触印刷术 3
1.6 接枝生物分子的性质 4
1.7 本课题的目的和意义 5
1.8 本课题的研究内容及技术路线 5
2 实验 6
2.1 样品、试剂及仪器 6
2.2 实验过程 7
2.3 表面结构的表征 9
3 实验结果与分析 10
3.1 ATR-FTIR分析 10
3.2 表面接触角分析 11
3.3 生物活性微图形对细胞粘附行为的影响 12
3.4 血小板粘附性能分析 14
结论 17
致谢 18
参考文献 19
1 绪论
1.1 问题的提出
生物材料是一种用于诊断和修复人体组织的天然或人造的材料[1,2]，随着社会的发展，它被广泛的运用于临床医学，并且已经取得了良好的效果。医用钛材作为生物医用金属材料的一种，凭借其良好的物化性质,逐渐成为应用广泛的植入材料。通过表面改性的方法,改变钛材表面的结构或性能,可以显著提高 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
致谢 18
参考文献 19
1 绪论
1.1 问题的提出
生物材料是一种用于诊断和修复人体组织的天然或人造的材料[1,2]，随着社会的发展，它被广泛的运用于临床医学，并且已经取得了良好的效果。医用钛材作为生物医用金属材料的一种，凭借其良好的物化性质,逐渐成为应用广泛的植入材料。通过表面改性的方法,改变钛材表面的结构或性能,可以显著提高钛材的生物相容性。
研究表明，材料表面的生物相容性不仅与材料表面的生物活性有关，也与材料表面的特定拓扑结构有关。近年来发展的微图形技术可以对材料表面的化学组成以及拓扑结构进行精确的设计，已经成为生物材料表面改性的重要技术手段。本课题采用微接触印刷术，在钛材的表面构建不同种类细胞外基质蛋白（纤连蛋白，纤连蛋白＋肝素）微图形。通过使用四种不同规格的印章，控制微图形的尺寸，以此来探索微图形对细胞和血液行为的影响规律。
1.2 医用钛材的性质和应用
生物材料应用广泛，一般依据组织和性质，将生物材料分为医用金属材料、高分子材料、无机材料三大类。钛属于医用金属材料，而且是一种同素异形体，与人体生理环境有着良好的反应。在自然条件或含氧的介质中，钛表面会很快结成一层致密的TiO2氧化膜，保护了钛基体不受腐蚀，即使遇到表面磨损或擦伤，氧化膜也可以再生。因此，氧化钛的高稳定性赋予其优异的耐生理腐蚀性能和良好的生物相容性，因此，钛及其合金材料在临床上常用做矫形外科材料和心血管植入材料，如，血管支架、血栓滤器、人工骨关节、膝关节、牙种植体等。
但是，钛作为一种金属材料，它与人体组织仍然存在着很多性能上的差异，并不能够完全替代人体组织和机构的功能。因此，人们常常通过表面改性技术[3]，来改善钛的表面结构和性能，如在钛表面接枝生物活性分子或在钛表面制备蛋白活性微图形[4-6]，来改善钛的生物活性。
1.3 生物相容性
生物相容性指生物医用材料植入人体以后与人体组织的相容程度，即生物材料可以被生物体或其组成单位接收或容纳的能力。生物相容性决定于植入材料的性质，当材料植入人体后，可能会造成体内细胞粘附和凝血等行为。因此，当材料作为医用植入材料时，要对其生物相容性做综合性的评价。一般来说，生物相容性包括细胞相容性和血液相容性两个方面。
细胞相容性指材料植入体内后，细胞在材料表面粘附与生长。一般来讲，研究细胞相容性的根本途径就是在材料表面种植和培养细胞，随着时间的推移，来观察细胞在材料表面的粘附生长情况，从而来判断此材料细胞相容性的好坏。类似的，血液相容性就是指材料与血液各成分之间的相容性，血液相容性较好的材料不会造成凝血和血栓[7]。它一般包含存活、粘附、增殖、分化几个方面，通过电镜观察血细胞与各种材料表面的附着情况，从血小板参与凝血的角度来判断该材料血液相容性的好坏。
1.4 微图形对内皮细胞生长及血液行为的调控
内皮细胞位于血液及血管组织之间，它能合成和分泌多种生物活性物质[8]，维持血管张力，防止血液凝固。在正常条件下，内皮细胞在体内沿血流方向规律性排列，这种形态和内皮的抗凝血性能密切相关。然而，目前内皮细胞在生物医用材料表面粘附的牢固程度和生长活性一直不能达到理想的效果，所以，进一步研究表面改性材料的表面结构，亲疏水性等性质对内皮细胞的影响是十分必要的。
在1911年，Harrison[9]就发现细胞可以对图形信号作出一定的反应。然而，微图形技术真正用于细胞研究始于上个世纪的70年代。郑楠[10]等利用光刻技术发现细胞在小于10um图形上的增殖大于无图形的钛表面,胡石琼[11]利用光刻技术制备的微图形试验，验证了微图形能够提高细胞与基体的粘附，Koh[12]等在表面制备柱状微图形,并研究了它对纤维蛋白原血小板粘附激活的影响,发现微图形可以降低纤维蛋白原的吸附和血小板的粘附。前人们所做的这些试验，都能够充分的说明，构建生物材料表面活性微图形，可以对细胞产生一定的调控作用[13]。
把生物活性分子采用微图形技术固定在医用钛材表面构建生物活性微图形，不仅可以调控细胞的形态和功能，还可以有望实现细胞的选择性生长和制备有序的高密度内皮细胞层[14]，从而制备出良好抗凝血性能的材料表面。研究表明，材料表面的微图形可以提高生物材料的生物相容性[15]，直接影响细胞的取向、黏附和形态，有效调控细胞的生长、蛋白表达等行为。除此以外，其表面分布的拓扑结构也会对血液及内皮细胞行为造成不同程度的影响[16]。因此，微图形逐渐成为材料表面改性的重要手段。目前，生物材料表面微图形化技术有很多种方法，其中包括激光光刻法、电化学法[17]等。然而，这些方法存在一些不足，比如激光光刻法在构建微图形的过程中容易带入杂质，直接影响内皮细胞的生长行为，电化学法相对于微接触印刷法也存在明显不足。
1.5 微接触印刷术
微接触印刷术[18]，简称uCP,被人们通俗的称呼为“蘸墨法”，它是在1993年由美国科学家Whitesides提出的[19]。它常用的材料是聚二甲基硅氧烷溶液PDMS，将PDMS浇在模板上，制作成为弹性印章。然后，用生物活性分子（纤连蛋白和肝素）溶液为“墨水”，用移液枪滴加至弹性印章表面，等到溶剂挥发后，将它印至基体材料表面。微接触印刷术比较适用于微米到纳米[20]级别精细图纹的印刷，最小甚至能够印几十纳米的图案，可用于超微器件的制备[21,22]。
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