pmo5原核蛋白表达
【目的】多糖单加氧酶（PMOs），又称糖苷水解酶家族（GH61），在木质纤维素分解过程中发挥了重要作用。本研究通过构建大肠杆菌Arctic Express表达载体，异源表达菌株Z5中多糖单加氧酶（PMOs）基因，经亲和层析纯化获得重组PMOs蛋白。【结果】经分析目标蛋白主要呈包涵体形式，上清中无表达或表达量低，因此通过变复性的方式，重溶目标蛋白PMO-5，通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。经Western Blot验证有目标蛋白的表达。【结论】本研究成功获得完整PMO-5基因，有助于详尽了解PMOs的功能。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 菌株，质粒，培养基与实验试剂3
1.2 主要仪器3
1.3 实验方法3
1.3.1 PCR扩增体系及程序3
1.3.2 大肠杆菌Top10感受态的制备与转化4
1.3.3 pLTE4481质粒构建4
1.3.4 pLTE4481载体转化至大肠杆菌Arctic Express4
1.3.5 IPTG诱导pLTE4481载体融合蛋白的表达5
1.3.6 pmo5His包涵体蛋白的变复性 5
1.3.7 融合蛋白的Ni柱亲和纯化5
1.3.8 Western blot检测5
2 结果与分析6
2.1 PMO5基因的序列分析6
2.2 pLTE4481质粒酶切鉴定7
2.3 pLTE4481的转化，筛选和鉴定7
2.4 蛋白表达纯化8
2.4.1 蛋白表达分析8
2.4.2 蛋白纯化分析8
2.5 Western blot检测 9
3 讨论9
致谢9
参考文献10
PMO5原核蛋白表达
引言
生物质作为地球上最丰富的可再生资源，有着广泛的应用前景，通过加工可转化成生物燃料，化工副产品以及药品等等[1]。纤维素和几丁质是生物质资源中含量最 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
丰硕，可利用发展潜力最大的两类物质。因此开发和应用纤维素和几丁质能够解决我国工业发展过程中造成的环境污染和缓解全球日益严重的能源危机，同时也是发展生物环保经济的重要途径。
将富含木质纤维素类物质的禽畜粪便、作物秸秆这类农业有机废弃物堆肥化处理，制成高附加值的商品有机肥和生物有机肥是利用生物质资源的重要方式。然而，传统的堆肥工艺耗时长，效率低，不符合我国当前的社会经济发展形势。我国科学研究的焦点已经逐渐转移到如何改进快速高效的堆肥工艺来处理这些农业废弃物。堆肥是有机物在多种微生物共同作用下被分解并转化成腐殖质的生物化学过程，该过程是由不同功能微生物交替完成。在堆肥初期，功能微生物的数量比较少，只有当功能微生物达到一定数量级后堆肥才能启动，故现代化的堆肥技术都强调接种功能微生物。大量研究表明，堆肥接种功能微生物可以加快堆肥的进程，有效杀灭有害微生物，改善堆肥的品质。
目前，降解纤维素和几丁质的主要方法是酶水解法，即利用糖苷水解酶系(Glycosyl hydrolase, GH)来完成催化降解过程[2]。然而，糖苷水解酶对于降解底物结晶区域的效率很低，因此需要对多糖底物进行化学法或物理法等预处理，将结晶底物转变为无定形底物以提高糖苷水解酶的降解效率[34]。但是，对底物结晶区的多重预处理却极大地提高了反应体系的复杂度，因而抑制了生物质的降解速率和效率。
最新研究表明，最初被碳水化合物活性酶数据库划分为糖苷水解酶61家族 (GH61) 和碳水化合物结合域33家族 (CBM33) 的一些成员具有多糖单加氧酶的活性[56]。这一重大发现改变了传统酶法降解结晶多糖的模式，也使得GH61成为了木质纤维素资源开发研究的新热点。大多数糖苷水解酶61家族基因没有水解活性，然而一些糖苷水解61家族水解酶在二价金属离子及还原剂存在时，可以显著减少木质纤维素水解所需要的木质纤维素酶量，不仅可以提高木质纤维的分解速率，而且可以降低功能微生物受降解物阻遏效应的影响[79]。PMOs可以分为PMO1和PMO2两大类，PMO1是从多糖链葡萄糖单体的C1位置夺取氢原子后形成内酯型糖，接着内酯型的糖又被转化为醛糖酸，被磷酸化后又可以通过磷酸戊糖途径被代谢；而PMO2则从多糖链葡萄糖单体C4位夺取氢原子生产非还原端被氧化的醛酮糖[10]。
Fig.1 多糖单加氧酶的分类[11]
Fig.1 The classification of PMOs
目前关于PMOs的作用机制主要有两个学术观点。Phillips等[12]的研究发现PMO首先与一个铜离子结合并形成PMOCu(II)并被一个电子还原为PMOCu(I)，随后氧分子与PMOCu(I)结合，同时氧分子的一个电子转移给Cu形成Cu的过氧化物中间体。该中间体能够从多糖链内部葡糖单体的C1或C4的位置夺取一个氢原子，同时形成过氧化氢铜的中间体和碳水化合物多糖的自由基。自由基与之前的碳水化合物多糖的自由基偶合，形成在C1或C4的羟基化多糖。加上去的氧原子使得多糖链不稳定，最终导致糖苷键的断裂，相邻的糖之间发生消除反应，形成糖内酯或醛酮糖。这种铜依赖酶通过纤维二糖脱氢酶或者小分子还原剂维生素C来进行氧化纤维素的作用[1214]。而Harris等[10]的研究发现PMOs有可能是与其他的酶系通过协同作用来实现促进木质纤维素的分解。他们利用Aspergillus oryzae同源表达了两个PMOs，分别为T.aurantiacus GH61和T.terrestris GH61E，当将这两个酶分别加到T.reesei SMA135的胞外酶系后，在相同酶量条件下可以大大提高其对纤维素的水解效率。Quinlan等[12]研究表明TaGH61A对BG有强烈协同作用，BG本身对玉米秸秆无水解作用，但是当向BG中加入一定量的TaGH61A后，玉米秸秆的转化效率可达到30%。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 菌株，质粒，培养基与实验试剂3
1.2 主要仪器3
1.3 实验方法3
1.3.1 PCR扩增体系及程序3
1.3.2 大肠杆菌Top10感受态的制备与转化4
1.3.3 pLTE4481质粒构建4
1.3.4 pLTE4481载体转化至大肠杆菌Arctic Express4
1.3.5 IPTG诱导pLTE4481载体融合蛋白的表达5
1.3.6 pmo5His包涵体蛋白的变复性 5
1.3.7 融合蛋白的Ni柱亲和纯化5
1.3.8 Western blot检测5
2 结果与分析6
2.1 PMO5基因的序列分析6
2.2 pLTE4481质粒酶切鉴定7
2.3 pLTE4481的转化，筛选和鉴定7
2.4 蛋白表达纯化8
2.4.1 蛋白表达分析8
2.4.2 蛋白纯化分析8
2.5 Western blot检测 9
3 讨论9
致谢9
参考文献10
PMO5原核蛋白表达
引言
生物质作为地球上最丰富的可再生资源，有着广泛的应用前景，通过加工可转化成生物燃料，化工副产品以及药品等等[1]。纤维素和几丁质是生物质资源中含量最 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
丰硕，可利用发展潜力最大的两类物质。因此开发和应用纤维素和几丁质能够解决我国工业发展过程中造成的环境污染和缓解全球日益严重的能源危机，同时也是发展生物环保经济的重要途径。
将富含木质纤维素类物质的禽畜粪便、作物秸秆这类农业有机废弃物堆肥化处理，制成高附加值的商品有机肥和生物有机肥是利用生物质资源的重要方式。然而，传统的堆肥工艺耗时长，效率低，不符合我国当前的社会经济发展形势。我国科学研究的焦点已经逐渐转移到如何改进快速高效的堆肥工艺来处理这些农业废弃物。堆肥是有机物在多种微生物共同作用下被分解并转化成腐殖质的生物化学过程，该过程是由不同功能微生物交替完成。在堆肥初期，功能微生物的数量比较少，只有当功能微生物达到一定数量级后堆肥才能启动，故现代化的堆肥技术都强调接种功能微生物。大量研究表明，堆肥接种功能微生物可以加快堆肥的进程，有效杀灭有害微生物，改善堆肥的品质。
目前，降解纤维素和几丁质的主要方法是酶水解法，即利用糖苷水解酶系(Glycosyl hydrolase, GH)来完成催化降解过程[2]。然而，糖苷水解酶对于降解底物结晶区域的效率很低，因此需要对多糖底物进行化学法或物理法等预处理，将结晶底物转变为无定形底物以提高糖苷水解酶的降解效率[34]。但是，对底物结晶区的多重预处理却极大地提高了反应体系的复杂度，因而抑制了生物质的降解速率和效率。
最新研究表明，最初被碳水化合物活性酶数据库划分为糖苷水解酶61家族 (GH61) 和碳水化合物结合域33家族 (CBM33) 的一些成员具有多糖单加氧酶的活性[56]。这一重大发现改变了传统酶法降解结晶多糖的模式，也使得GH61成为了木质纤维素资源开发研究的新热点。大多数糖苷水解酶61家族基因没有水解活性，然而一些糖苷水解61家族水解酶在二价金属离子及还原剂存在时，可以显著减少木质纤维素水解所需要的木质纤维素酶量，不仅可以提高木质纤维的分解速率，而且可以降低功能微生物受降解物阻遏效应的影响[79]。PMOs可以分为PMO1和PMO2两大类，PMO1是从多糖链葡萄糖单体的C1位置夺取氢原子后形成内酯型糖，接着内酯型的糖又被转化为醛糖酸，被磷酸化后又可以通过磷酸戊糖途径被代谢；而PMO2则从多糖链葡萄糖单体C4位夺取氢原子生产非还原端被氧化的醛酮糖[10]。
Fig.1 多糖单加氧酶的分类[11]
Fig.1 The classification of PMOs
目前关于PMOs的作用机制主要有两个学术观点。Phillips等[12]的研究发现PMO首先与一个铜离子结合并形成PMOCu(II)并被一个电子还原为PMOCu(I)，随后氧分子与PMOCu(I)结合，同时氧分子的一个电子转移给Cu形成Cu的过氧化物中间体。该中间体能够从多糖链内部葡糖单体的C1或C4的位置夺取一个氢原子，同时形成过氧化氢铜的中间体和碳水化合物多糖的自由基。自由基与之前的碳水化合物多糖的自由基偶合，形成在C1或C4的羟基化多糖。加上去的氧原子使得多糖链不稳定，最终导致糖苷键的断裂，相邻的糖之间发生消除反应，形成糖内酯或醛酮糖。这种铜依赖酶通过纤维二糖脱氢酶或者小分子还原剂维生素C来进行氧化纤维素的作用[1214]。而Harris等[10]的研究发现PMOs有可能是与其他的酶系通过协同作用来实现促进木质纤维素的分解。他们利用Aspergillus oryzae同源表达了两个PMOs，分别为T.aurantiacus GH61和T.terrestris GH61E，当将这两个酶分别加到T.reesei SMA135的胞外酶系后，在相同酶量条件下可以大大提高其对纤维素的水解效率。Quinlan等[12]研究表明TaGH61A对BG有强烈协同作用，BG本身对玉米秸秆无水解作用，但是当向BG中加入一定量的TaGH61A后，玉米秸秆的转化效率可达到30%。
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