肝素和硫酸软骨素的两类纳米颗粒调节血管细胞行为的研究
目录
1 绪 论 1
1.1、研究背景 1
1.2、生物医用不锈钢材料 2
1.3、不锈钢材料表面改性研究 2
1.4两类纳米颗粒调节血管细胞行为的研究 3
1.5.多聚赖氨酸和多巴胺 5
1.6本课题研究的目的及意义 7
1.7本课题的研究内容与技术路线 8
2 两种纳米颗粒在材料表面的固定及表征 9
2.1纳米颗粒的制备及固定 9
2.2 纳米颗粒性质表征（Zeta电位，粒径，PDI） 9
2.3 表面理化性质表征 10
2.4 表面形貌 12
2.5 水接触角 12
2.6 生物分子定量检测结果 14
3 表面生物相容性评价 16
3.1血小板粘附实验 16
3.2细胞相容性评价 17
结论 20
致 谢 21
参考文献 22
1 绪 论
1.1、研究背景
1.1.1冠心病
目前，心血管疾病已成为威胁人类生命的头号杀手，所谓心脑血管疾病就是心脏血管和脑血管的疾病统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生缺血性或出血性疾病。是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍可有50%以上的脑血管疾病者生活仍然不能完全自理，每年全世界死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，死亡人数居各种疾病第一位[1]。冠心病通常是指冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
.com/subview/1234403/1234403.htm>、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病” [2]。但是冠心病的范围可能更广泛，还包括栓塞、炎症等导致管腔狭窄或闭塞。在临床中，动脉粥状硬化一般采用冠状动脉血管支架介入治疗和动脉搭桥[3]。
1.1.2、血管支架介入治疗
血管支架是指在管腔球囊扩张成形的基础上，在病变段置入内支架以达到减少血管弹性回缩及再塑形，支撑狭窄闭塞段血管，从而能够保持管腔血流通畅。有些内支架还具有预防再狭窄等一系列的作用。主要分为脑血管支架、冠脉支架、大动脉支架、肾动脉支架等[4]。
支架治疗冠心病的临床疗效是很显著的，但它也有一些缺点，支架在植入人体的6～8月后可能会出现支架内再狭窄，即出现再堵塞。最初金属支架流行的时候再狭窄的发生率约20%（15%～40%）[5]；现在发展为药物支架，再狭窄发生率下降到了9%左右。一般手术后半年再复查冠脉造影，如果没有出现支架内再狭窄，那么以后就很少会出现再狭窄了。
那么是否永远不会出现再狭窄了呢？如果术后康复方式不对，依然会出现再狭窄。一位接受支架植入6年的患者，出现了支架内再狭窄[6]。也有可能是因为术后没有保养好。所以，出现再狭窄可能是多种因素造成的。
药物洗脱支架（DES）的出现是冠状动脉介入医疗史上具有里程碑意义的进步，他使冠状动介入治疗术后再狭窄发生率自的35％～55％下降至15％以下[7]。药物洗脱支架的优势极大促进了冠状动脉介入技术的发展，在全球范围内DES植入的绝对量和相对比率均迅速增长。同时，各种新型DES也不断出现。
1.2、生物医用不锈钢材料
生物医用不锈钢材料这是用于生物医学材料的金属或合金，又称外科用不锈钢材料，是一种惰性材料。这种材料具有高机械强度、易加工和抗疲劳等优良性能，是临床应用最广泛使用的植入材料[7]。这种材料在生活中很多都用到，如外科辅助器材等各个方面。不锈钢(316L SS)具有良好的机械性能和优良的抗腐蚀性能，是血管支架最常使用的金属材料。但是镍、钼离子以及铬酸盐从材料表面的释放可能会引发内膜增生与支架内再狭窄，很多材料与方法被尝试用于316L SS 支架的表面修饰以提高生物相容性[8]。使用电化学循环动电位钝化法对316L SS支架的表面进行处理后，表面几乎没有血小板聚集，但存在的问题是该表面对于内皮细胞和平滑肌细胞的粘附没有选择性。
1.3、不锈钢材料表面改性研究
1.3.1抗凝性
抗凝是应用物理或化学方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子，阻止血液凝固，称为抗凝。能够阻止血液凝固的化学试剂或物质，称为抗凝剂或抗凝物质。 如天然抗凝剂（肝素 ，水蛭素 等） Ca+2鳌合剂（柠檬酸钠，氟化钾 ）。
血液抗凝是非常必要的，主要是除掉或抑制血液中的某些凝血因子，阻止血液凝固，否则的话，会造成组织坏死。肝素化表面首次报道于1963年，肝素具有抗凝血和抗炎症性能，肝素是通过加强抗凝血酶Ⅲ，抑制他的活性。灭活丝氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成来达到抗凝的目的。因此被广泛用于心血管材料表面修饰[9]。肝素涂覆支架表面后，与未修饰表面相比，激活的血小板较少。核酸适配子是RNA和DNA序列，来自体外的一个序列库，库中的随机序列包含几百个核苷酸，对于给定的配体分子具有高亲和力和专一性结合的能力。适配子在心血管疾病中作为治疗性的抗凝剂得到非常好的应用。在介入医疗中，外物介入会引起内部排斥，会造成凝血：首先在材料与血液接触瞬间，血浆蛋白分子会吸附在材料的表面，吸附的血浆蛋白分子中细胞核的构象会发生变化，然后血细胞会粘附、变形从而激活，或通过聚集并释放大量的凝血因子，产生凝血酶，激活更多的凝血因子，循环发生凝血反应最终导致凝血过程级联反应进而形成血栓[10]，具体过程见图1-1。
图1-1 生物材料与血液接触导致凝血的过程
1.3.2促内皮再生
同样，促内皮再生也很重要，因为不管何种手术，都会在人体留下创伤，如何让组织恢复原有功能，是一重大研究课题[11]。用于提高表面生物学行为的生物分子包括雌激素和血小板衍生生长因子受体抑制剂等，雌激素，尤其是衍生物17-β-雌激素已经引入到心血管系统，显示出防御早期粥样斑块的作用，同时，17-β-雌激素能够促进重新内皮化，抑制平滑肌增生与迁移、防止再狭窄。动物试验表明，雌激素能够加快损伤处内皮细胞的应答修复，减少内膜增生，雌激素涂覆的支架通过减少内膜增生来防止猪模型植入支架后的支架内再狭窄[12]。雌激素也可以通过等离子体聚合经可水解的共价键耦合到金属表面上，以促进内皮再生。
1.4两类纳米颗粒调节血管细胞行为的研究
本课题将制备出肝素和硫酸软骨素两类纳米颗粒，并固定于多巴胺涂覆的不锈钢表面。这两种物质具有相似的结构，但在抗凝及影响细胞生长行为方面却表现出不同的优势，本研究将通过体外理化性质表征及生物相容性评价，对两类纳米颗粒修饰的表面其生物相容性的异同进行重点讨论。
当生物材料置于血浆或血清中时，白蛋白会强烈的结合到疏水性表面（θ>90°），而构象激活粘附性蛋白如纤粘连蛋白（Fn）和玻粘连蛋白（Vn）则优先在亲水性表面（θ﹤90°）上吸附，且随着表面亲水性的增加，表面蛋白质吸附的可逆性增强，容易被取代。本实验中，样品表面亲水性范围更有利于粘性蛋白的吸附，从而表现出更好的促进细胞生长效果。
1 绪 论 1
1.1、研究背景 1
1.2、生物医用不锈钢材料 2
1.3、不锈钢材料表面改性研究 2
1.4两类纳米颗粒调节血管细胞行为的研究 3
1.5.多聚赖氨酸和多巴胺 5
1.6本课题研究的目的及意义 7
1.7本课题的研究内容与技术路线 8
2 两种纳米颗粒在材料表面的固定及表征 9
2.1纳米颗粒的制备及固定 9
2.2 纳米颗粒性质表征（Zeta电位，粒径，PDI） 9
2.3 表面理化性质表征 10
2.4 表面形貌 12
2.5 水接触角 12
2.6 生物分子定量检测结果 14
3 表面生物相容性评价 16
3.1血小板粘附实验 16
3.2细胞相容性评价 17
结论 20
致 谢 21
参考文献 22
1 绪 论
1.1、研究背景
1.1.1冠心病
目前，心血管疾病已成为威胁人类生命的头号杀手，所谓心脑血管疾病就是心脏血管和脑血管的疾病统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生缺血性或出血性疾病。是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍可有50%以上的脑血管疾病者生活仍然不能完全自理，每年全世界死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，死亡人数居各种疾病第一位[1]。冠心病通常是指冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血
.com/subview/1234403/1234403.htm>、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病” [2]。但是冠心病的范围可能更广泛，还包括栓塞、炎症等导致管腔狭窄或闭塞。在临床中，动脉粥状硬化一般采用冠状动脉血管支架介入治疗和动脉搭桥[3]。
1.1.2、血管支架介入治疗
血管支架是指在管腔球囊扩张成形的基础上，在病变段置入内支架以达到减少血管弹性回缩及再塑形，支撑狭窄闭塞段血管，从而能够保持管腔血流通畅。有些内支架还具有预防再狭窄等一系列的作用。主要分为脑血管支架、冠脉支架、大动脉支架、肾动脉支架等[4]。
支架治疗冠心病的临床疗效是很显著的，但它也有一些缺点，支架在植入人体的6～8月后可能会出现支架内再狭窄，即出现再堵塞。最初金属支架流行的时候再狭窄的发生率约20%（15%～40%）[5]；现在发展为药物支架，再狭窄发生率下降到了9%左右。一般手术后半年再复查冠脉造影，如果没有出现支架内再狭窄，那么以后就很少会出现再狭窄了。
那么是否永远不会出现再狭窄了呢？如果术后康复方式不对，依然会出现再狭窄。一位接受支架植入6年的患者，出现了支架内再狭窄[6]。也有可能是因为术后没有保养好。所以，出现再狭窄可能是多种因素造成的。
药物洗脱支架（DES）的出现是冠状动脉介入医疗史上具有里程碑意义的进步，他使冠状动介入治疗术后再狭窄发生率自的35％～55％下降至15％以下[7]。药物洗脱支架的优势极大促进了冠状动脉介入技术的发展，在全球范围内DES植入的绝对量和相对比率均迅速增长。同时，各种新型DES也不断出现。
1.2、生物医用不锈钢材料
生物医用不锈钢材料这是用于生物医学材料的金属或合金，又称外科用不锈钢材料，是一种惰性材料。这种材料具有高机械强度、易加工和抗疲劳等优良性能，是临床应用最广泛使用的植入材料[7]。这种材料在生活中很多都用到，如外科辅助器材等各个方面。不锈钢(316L SS)具有良好的机械性能和优良的抗腐蚀性能，是血管支架最常使用的金属材料。但是镍、钼离子以及铬酸盐从材料表面的释放可能会引发内膜增生与支架内再狭窄，很多材料与方法被尝试用于316L SS 支架的表面修饰以提高生物相容性[8]。使用电化学循环动电位钝化法对316L SS支架的表面进行处理后，表面几乎没有血小板聚集，但存在的问题是该表面对于内皮细胞和平滑肌细胞的粘附没有选择性。
1.3、不锈钢材料表面改性研究
1.3.1抗凝性
抗凝是应用物理或化学方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子
血液抗凝是非常必要的，主要是除掉或抑制血液中的某些凝血因子，阻止血液凝固，否则的话，会造成组织坏死。肝素化表面首次报道于1963年，肝素具有抗凝血和抗炎症性能，肝素是通过加强抗凝血酶Ⅲ，抑制他的活性。灭活丝氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成来达到抗凝的目的。因此被广泛用于心血管材料表面修饰[9]。肝素涂覆支架表面后，与未修饰表面相比，激活的血小板较少。核酸适配子是RNA和DNA序列，来自体外的一个序列库，库中的随机序列包含几百个核苷酸，对于给定的配体分子具有高亲和力和专一性结合的能力。适配子在心血管疾病中作为治疗性的抗凝剂得到非常好的应用。在介入医疗中，外物介入会引起内部排斥，会造成凝血：首先在材料与血液接触瞬间，血浆蛋白分子会吸附在材料的表面，吸附的血浆蛋白分子中细胞核的构象会发生变化，然后血细胞会粘附、变形从而激活，或通过聚集并释放大量的凝血因子，产生凝血酶，激活更多的凝血因子，循环发生凝血反应最终导致凝血过程级联反应进而形成血栓[10]，具体过程见图1-1。
图1-1 生物材料与血液接触导致凝血的过程
1.3.2促内皮再生
同样，促内皮再生也很重要，因为不管何种手术，都会在人体留下创伤，如何让组织恢复原有功能，是一重大研究课题[11]。用于提高表面生物学行为的生物分子包括雌激素和血小板衍生生长因子受体抑制剂等，雌激素，尤其是衍生物17-β-雌激素已经引入到心血管系统，显示出防御早期粥样斑块的作用，同时，17-β-雌激素能够促进重新内皮化，抑制平滑肌增生与迁移、防止再狭窄。动物试验表明，雌激素能够加快损伤处内皮细胞的应答修复，减少内膜增生，雌激素涂覆的支架通过减少内膜增生来防止猪模型植入支架后的支架内再狭窄[12]。雌激素也可以通过等离子体聚合经可水解的共价键耦合到金属表面上，以促进内皮再生。
1.4两类纳米颗粒调节血管细胞行为的研究
本课题将制备出肝素和硫酸软骨素两类纳米颗粒，并固定于多巴胺涂覆的不锈钢表面。这两种物质具有相似的结构，但在抗凝及影响细胞生长行为方面却表现出不同的优势，本研究将通过体外理化性质表征及生物相容性评价，对两类纳米颗粒修饰的表面其生物相容性的异同进行重点讨论。
当生物材料置于血浆或血清中时，白蛋白会强烈的结合到疏水性表面（θ>90°），而构象激活粘附性蛋白如纤粘连蛋白（Fn）和玻粘连蛋白（Vn）则优先在亲水性表面（θ﹤90°）上吸附，且随着表面亲水性的增加，表面蛋白质吸附的可逆性增强，容易被取代。本实验中，样品表面亲水性范围更有利于粘性蛋白的吸附，从而表现出更好的促进细胞生长效果。
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