图形化的纤连蛋白肝素多功能表面对血管细胞行为的调控研究
对心血管人工植入材料如冠脉支架而言，内膜增生和血栓的形成是其植入后面临的主要问题。通过表面生物功能改性，提高表面的血液相容性，同时加速表面内皮再生是当前研究的主要手段。本论文利用肝素与纤连蛋白之间的特异性结合作用，构建出肝素/纤连蛋白复合物。同时借助微接触印刷技术，通过PDMS印章在多巴胺涂覆的钛（Ti）表面印刷不同尺寸的肝素/纤连蛋白微图形。本研究通过扫描电子显微镜（SEM）、接触角测量仪、傅里叶红外变换光谱分析（FTIR）和生物分子定量的方法对改性后的钛表面进行理化性质表征。通过体外血小板粘附实验对表面血液相容性进行评价，通过体外内皮细胞种植实验对表面内皮细胞生长及增殖活性进行评价。研究结果显示，肝素/纤连蛋白复合物成功印刷至Ti表面，且肝素/纤连蛋白区域具有选择性抑制血小板粘附和激活，促进内皮细胞再生的效果。关键词 肝素，纤连蛋白，血小板，内皮细胞，微图形目 录
第1章 绪 论 1
1.1 生物医用材料概述 1
1.2 生物医用金属材料的表面改性技术 2
1.3 生物医用材料抗凝血性和促内皮化的研究 4
1.4本论文的研究内容及技术路线 6
第2章 钛表面肝素/纤连蛋白微图形的构建 8
2.1 试剂及仪器 8
2.2 微图形的设计及PDMS印章的制备 9
2.3 材料表面微接触印刷纤连蛋白/肝素图形 9
第3章 表征及结果分析 10
3.1 傅里叶变换红外光谱 10
3.2 水接触角检测 11
3.3 表面形貌表征 12
3.4 甲苯胺蓝法定量肝素 12
第4章 细胞相容性和血液相容性评价结果及分析 15
4.1 细胞相容性评价方法及结果分析 15
4.2 血小板粘附试验 16
结论 18
致谢 19
参 考 文 献 20
第1章 绪 论
1.1 生物医用材料概述
1.1.1 生物医用材料定义
生物医用材料(Biomedical Materials)是用来对生物体进行诊断、修复、治疗或替换其病损组织、器官或增进其功 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
分析 15
4.2 血小板粘附试验 16
结论 18
致谢 19
参 考 文 献 20
第1章 绪 论
1.1 生物医用材料概述
1.1.1 生物医用材料定义
生物医用材料(Biomedical Materials)是用来对生物体进行诊断、修复、治疗或替换其病损组织、器官或增进其功能的新型高技术材料[1]。
在不同的历史时期，生物医用材料被赋予了不同的意义，其定义是随着生命科学和材料科学的不断发展而演变的，依据生物医用材料的发展历史及材料本身的特点，已有的材料可分为三代[2]，但它们都有共同的特征，即生物医用材料是一类人工或天然的材料，可以单独或与药物一起制成部件、器械用于组织或器官的治疗、增强或替代，并在有效使用期内不会对宿主引起急性或慢性危害。
1.1.2 生物医用材料的分类
生物医用材料按用途可分为皮肤、乳房、食道、呼吸道、膀胱等软组织材料，骨、牙、关节、肌腱等骨骼-肌肉系统修复材料，人工心脏瓣膜、心血管内插管等心血管系统材料，气体选择性透过膜、血液净化膜和分离膜等医用膜材料，临床诊断，生物传感器材料，药物释放载体材料等。
1.1.3 生物医用材料的性能要求
金属生物医用材料与工业用金属材料不同，它用量小，品种多，规格不一，要求严格。因为人体生理环境处于动态反应系统中，若将以用金属材料植入到体内，其使用环境是十分复杂的，在实验室内一般无法模拟。人体对于异物是非常敏感的，不仅要对人体安全无害，对周围组织，血液不能产生不利影响，还要达到很好的修复和治疗的目的。金属材料很难与生物组织产生亲和作用，一般不具有生物活性。对金属生物医用材料的一般要求可以归纳为：材料与人体的生物相容性要求、材料在人体环境中的耐腐蚀性要求和材料的力学性能要求[3]。
1.将生物相容性具体化，可分为八个方面的要求[3]：
化学稳定性，无毒性和变态反应；
良好的生物组织适应性；
无致癌性和抗原性；
不引起血栓和溶血；
不引起新陈代谢异常；
在人体中无降解和分解；
无析出物；
不产生吸附和沉淀物。
2.耐腐蚀性能要求：植入人体内的金属生物医用材料长期处于含有有机酸、碱金属或碱金属离子（Na +，K+，Ca2+）、Cl-离子等构成的恒温（37℃）电解质的环境中，加之蛋白、酶和细胞的作用，其环境非常复杂，会对金属材料产生腐蚀，腐蚀产物会对正常组织产生影响和刺激。所以，作为金属生物医用材料，一方面要求自身具有良好的钝化特性、适合的成分与微观组织结构；另一方面，当设计和加工金属植入器件时，注重改善材料的表面质量，如改善植入器件的表面粗糙度等，避免制品在形状、力学设计及材料匹配上出现不当，造成局部腐蚀的发生。
3. 力学性能要求：金属生物医用材料有些是作为受力器件植入的，如人工关节、人工椎体、骨折固定装置、骨钉等。要使植入器件的使用寿命得到保证，其材料必须具有优良的力学性能和耐磨损性。
对金属生物医用材料的力学性能要求主要有以下方面：
足够的强度和韧性；
弹性疲劳、变形；
磨损及摩擦性能与组织相容
硬度与组织植入区相近
弹性与组织相容
表面粗糙度根据具体情况决定
1.2 生物医用金属材料的表面改性技术
1.2.1 生物医用材料的机械表面改性
生物医用材料表面改性的机械方法包括机械表面加工和机械表面处理。机械表面加工的目的是达到零件最终要求的尺寸、形状、精度及特性；而机械表面处理一般属于表面处理钱的预备工序，主要包括喷丸处理和光亮化处理[4]。对于与骨、齿等硬组织接触的植入材料来说，表面平整光滑的材料与组织接触后，周围形成的是一层较厚的与材料无结合的包囊组织。增加表面粗糙度可以增加细胞在植入材料表面的黏附、增殖和分化，并且增加表面粗糙度使植入人体与骨组织接触面积增加，机械锁合强度增加，提高了长期在体内的植入材料的良性反应。研究表明，增加表面粗糙度有利于骨细胞黏附、增殖和分化[5-7]。
另外，材料表面粗糙度也是影响血液相容性的一个很重要的因素。一般来言，材料表面越光滑，对血浆蛋白和血小板的吸附就越小，越不易引起血细胞形态和构像的变化，也就越不易破坏血液的正常流动。
1.2.2 生物医用材料的物理化学表面改性
生物医用材料的物理表面改性是一种经济有效的表面加工技术，在生物学领域已显示出巨大的优越性，从20世纪七八十年代开始发展，目前已形成了一个独立的研究方向，主要是讲等离子在直流电弧放电、辉光放电、电晕放电等条件下产生的部分电离气体与材料表面发生普通情况下难以完成的过程[8]。
物理表面改性主要由如下特点：
良好的可靠性、重现性、非线性以及低成本，可以应用于各种形状的金
属、聚合物、陶瓷以及复合材料；
可对生物材料和器械表面进行消毒清洗；
工艺简单，操作方便，易于控制，对环境无污染。
生物医用材料的化学表面改性主要有溶胶-凝胶法，电化学法，仿生溶液法，气相沉积法。陈俊英等[9]通过氢等离子体浸没离子注入沉积到氧化钛薄膜表面，与未经处理的薄膜相比，氢离子注入后的薄膜更能促
第1章 绪 论 1
1.1 生物医用材料概述 1
1.2 生物医用金属材料的表面改性技术 2
1.3 生物医用材料抗凝血性和促内皮化的研究 4
1.4本论文的研究内容及技术路线 6
第2章 钛表面肝素/纤连蛋白微图形的构建 8
2.1 试剂及仪器 8
2.2 微图形的设计及PDMS印章的制备 9
2.3 材料表面微接触印刷纤连蛋白/肝素图形 9
第3章 表征及结果分析 10
3.1 傅里叶变换红外光谱 10
3.2 水接触角检测 11
3.3 表面形貌表征 12
3.4 甲苯胺蓝法定量肝素 12
第4章 细胞相容性和血液相容性评价结果及分析 15
4.1 细胞相容性评价方法及结果分析 15
4.2 血小板粘附试验 16
结论 18
致谢 19
参 考 文 献 20
第1章 绪 论
1.1 生物医用材料概述
1.1.1 生物医用材料定义
生物医用材料(Biomedical Materials)是用来对生物体进行诊断、修复、治疗或替换其病损组织、器官或增进其功 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
分析 15
4.2 血小板粘附试验 16
结论 18
致谢 19
参 考 文 献 20
第1章 绪 论
1.1 生物医用材料概述
1.1.1 生物医用材料定义
生物医用材料(Biomedical Materials)是用来对生物体进行诊断、修复、治疗或替换其病损组织、器官或增进其功能的新型高技术材料[1]。
在不同的历史时期，生物医用材料被赋予了不同的意义，其定义是随着生命科学和材料科学的不断发展而演变的，依据生物医用材料的发展历史及材料本身的特点，已有的材料可分为三代[2]，但它们都有共同的特征，即生物医用材料是一类人工或天然的材料，可以单独或与药物一起制成部件、器械用于组织或器官的治疗、增强或替代，并在有效使用期内不会对宿主引起急性或慢性危害。
1.1.2 生物医用材料的分类
生物医用材料按用途可分为皮肤、乳房、食道、呼吸道、膀胱等软组织材料，骨、牙、关节、肌腱等骨骼-肌肉系统修复材料，人工心脏瓣膜、心血管内插管等心血管系统材料，气体选择性透过膜、血液净化膜和分离膜等医用膜材料，临床诊断，生物传感器材料，药物释放载体材料等。
1.1.3 生物医用材料的性能要求
金属生物医用材料与工业用金属材料不同，它用量小，品种多，规格不一，要求严格。因为人体生理环境处于动态反应系统中，若将以用金属材料植入到体内，其使用环境是十分复杂的，在实验室内一般无法模拟。人体对于异物是非常敏感的，不仅要对人体安全无害，对周围组织，血液不能产生不利影响，还要达到很好的修复和治疗的目的。金属材料很难与生物组织产生亲和作用，一般不具有生物活性。对金属生物医用材料的一般要求可以归纳为：材料与人体的生物相容性要求、材料在人体环境中的耐腐蚀性要求和材料的力学性能要求[3]。
1.将生物相容性具体化，可分为八个方面的要求[3]：
化学稳定性，无毒性和变态反应；
良好的生物组织适应性；
无致癌性和抗原性；
不引起血栓和溶血；
不引起新陈代谢异常；
在人体中无降解和分解；
无析出物；
不产生吸附和沉淀物。
2.耐腐蚀性能要求：植入人体内的金属生物医用材料长期处于含有有机酸、碱金属或碱金属离子（Na +，K+，Ca2+）、Cl-离子等构成的恒温（37℃）电解质的环境中，加之蛋白、酶和细胞的作用，其环境非常复杂，会对金属材料产生腐蚀，腐蚀产物会对正常组织产生影响和刺激。所以，作为金属生物医用材料，一方面要求自身具有良好的钝化特性、适合的成分与微观组织结构；另一方面，当设计和加工金属植入器件时，注重改善材料的表面质量，如改善植入器件的表面粗糙度等，避免制品在形状、力学设计及材料匹配上出现不当，造成局部腐蚀的发生。
3. 力学性能要求：金属生物医用材料有些是作为受力器件植入的，如人工关节、人工椎体、骨折固定装置、骨钉等。要使植入器件的使用寿命得到保证，其材料必须具有优良的力学性能和耐磨损性。
对金属生物医用材料的力学性能要求主要有以下方面：
足够的强度和韧性；
弹性疲劳、变形；
磨损及摩擦性能与组织相容
硬度与组织植入区相近
弹性与组织相容
表面粗糙度根据具体情况决定
1.2 生物医用金属材料的表面改性技术
1.2.1 生物医用材料的机械表面改性
生物医用材料表面改性的机械方法包括机械表面加工和机械表面处理。机械表面加工的目的是达到零件最终要求的尺寸、形状、精度及特性；而机械表面处理一般属于表面处理钱的预备工序，主要包括喷丸处理和光亮化处理[4]。对于与骨、齿等硬组织接触的植入材料来说，表面平整光滑的材料与组织接触后，周围形成的是一层较厚的与材料无结合的包囊组织。增加表面粗糙度可以增加细胞在植入材料表面的黏附、增殖和分化，并且增加表面粗糙度使植入人体与骨组织接触面积增加，机械锁合强度增加，提高了长期在体内的植入材料的良性反应。研究表明，增加表面粗糙度有利于骨细胞黏附、增殖和分化[5-7]。
另外，材料表面粗糙度也是影响血液相容性的一个很重要的因素。一般来言，材料表面越光滑，对血浆蛋白和血小板的吸附就越小，越不易引起血细胞形态和构像的变化，也就越不易破坏血液的正常流动。
1.2.2 生物医用材料的物理化学表面改性
生物医用材料的物理表面改性是一种经济有效的表面加工技术，在生物学领域已显示出巨大的优越性，从20世纪七八十年代开始发展，目前已形成了一个独立的研究方向，主要是讲等离子在直流电弧放电、辉光放电、电晕放电等条件下产生的部分电离气体与材料表面发生普通情况下难以完成的过程[8]。
物理表面改性主要由如下特点：
良好的可靠性、重现性、非线性以及低成本，可以应用于各种形状的金
属、聚合物、陶瓷以及复合材料；
可对生物材料和器械表面进行消毒清洗；
工艺简单，操作方便，易于控制，对环境无污染。
生物医用材料的化学表面改性主要有溶胶-凝胶法，电化学法，仿生溶液法，气相沉积法。陈俊英等[9]通过氢等离子体浸没离子注入沉积到氧化钛薄膜表面，与未经处理的薄膜相比，氢离子注入后的薄膜更能促
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