层粘连蛋白肝素微图形化表面对生物相容性的影响与研究
血管支架介入治疗在临床上，常使用金属制血管支架植入病变血管处，内部气囊撑开堵塞的血管，以恢复血流通畅，从而达到治疗的目的。然而，由材料或器械植入而引发的表面凝血反应及内皮功能紊乱所引发的血栓和再狭窄常常导致介入治疗的失败。因此需要对血管支架材料进行表面改性，以达到抗凝血和促进内皮化的功能。本课题研究选择抗凝物质肝素和促细胞粘附分子层粘连蛋白作为研究对象，利用两种分子间的结构域作用，制备层粘连蛋白/肝素复合物用于表面改性，同时通过表面微图形技术的PDMS印章法，实现多功能复合物在材料表面的可视化微图形分布。本课题研究通过傅里叶红外光谱分析（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）、水接触角分析和甲苯胺蓝染色以及血液相容性和细胞相容性评价。研究结果显示，层粘连蛋白/肝素复合物成功固定于多巴胺涂层表面，并形成微图形化分布，且层粘连蛋白/肝素微图形化表面具有选择性抗凝和促进内皮化的作用。关键词 层粘连蛋白/肝素，生物相容性，微图形化，抗凝，促进内皮化
目 录
1 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2 血管支架材料 2
1.3 血液与细胞相容性 3
1.3.1 材料的血液相容性 3
1.3.2 材料的细胞相容性 3
1.4 肝素与层粘连蛋白的复合 4
1.5 微图形化 5
1.5.1 微图形化技术 5
1.5.2 微图形化技术分类 5
1.6 目的和意义 7
1.7 本课题的研究内容和技术路线 7
2 实验 9
2.1样品、试剂及仪器 9
2.1.1 样品 9
2.1.2 试剂 9
2.1.3 实验仪器 10
2.2 实验过程 10
2.2.1 多巴胺涂层沉积 10
2.2.2 层粘连蛋白/肝素复合物的微图形化表面的制备与固定 11
3 材料学表征的结果与分析 11
3.1傅里叶红外光谱分析（FTIR） 11
3.2 水接触角 12
3.3肝素及RGD密度定量检测结果 13
3.3.1 检测原理 13
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
3.3.2 检测结果和分析 14
3.4 扫描电子显微镜（SEM）表面形貌 15
4 层粘连蛋白/肝素微图形化表面的生物相容性评价 15
4.1血小板粘附实验 15
4.1.1血小板粘附实验步骤和方法 15
4.1.2实验结果和分析 16
4.2 内皮细胞体外培养实验 17
4.2.1 内皮细胞体外培养实验的方法 17
4.2.2 实验结果和分析 18
结 论 20
致 谢 21
参考文献 22
1 绪论
1.1 研究背景
冠心病又称冠状动脉粥样硬化性心脏病，是冠状动脉血管发生病变而引起血管狭窄或阻塞，造成心脏供血供氧不足而导致心肌坏死的心脏病[1]。但冠心病的范围可能更加广泛，还包括炎症、血栓等导致血管狭窄或闭塞的症状。冠心病在我国发病率和死亡率正在增加，且近年来增加速度较为明显。此外，导致冠心病的危险因素水平也在升高[2]。《中国心血管病报告2014》指出，现在全国心血管病患者2.9亿，每5个成人中就有1名患心血管病。而在心血管疾病中，冠心病、高血压和高血脂在我国中老年人群中最为普遍。临床上，动脉粥状硬化一般采用冠状动脉血管支架介入治疗、外科手术（动脉搭桥）和药物治疗[3]。而介入治疗一般采用不锈钢或钛合金等生物医用材料制备的血管支架进行介入治疗。但由于材料表面抗凝血性差和非特异性抗增生药物造成内皮损伤修复延迟以及生物相容性等缺陷，导致血栓和再狭窄的发生。因此，选择一种合适的表面功能层构建方法或表面改性技术，使血管支架材料表面具有选择性抗凝、抑制内膜增生，同时促进内皮再生的能力，是冠心病介入治疗的发展趋势和未来目标。
肝素（Heparin）作为一种抗凝剂，在体内外都有抗凝血作用。所以，如果通过某种生物连接方式使肝素固定到血管支架的材料表面，就能抑制凝血反应（增强抗凝血酶Ⅲ与凝血酶的亲和力，加剧凝血酶的失活，达到抗凝的目的）、抗炎症反应（作用于补体系统的多个环节以及补体蛋白，以抑制系统组织过度激活）和抑制血小板，并增加血管壁的通透性和调控血管新生[4]。受到贝壳类海洋生物分泌的黏附性蛋白质能固定连接到船壳的合金上的启发 ，发现聚多巴胺的粘附机理和性能[5]。结果表明,多巴胺（3,4二羟基苯丙氨酸）可沉积在不同材料基体的表面，包括有机材料和金属材料[5]。其原理是多巴胺的邻苯二酚羟基和氨基基团活性比较高，能与各种材料以共价键和非共价键形成很强的界面结合力。同时发现多巴胺氧化后形成的特殊的邻二醌结构能与含氨基的生物分子发生迈克尔加成反应和西弗碱反应[6]。而肝素不含氨基或巯基，因此无法直接连接到多巴胺涂层。
由此，引入一种中间过渡层层粘连蛋白（laminin, LN)，一种肝素结合性蛋白，含有蛋白质特有的氨基并能调节血管内皮细胞粘附、生长及迁移。
从而肝素和层粘连蛋白的复合物通过迈克尔加成反应和西弗碱反应以及化学键的作用连接到具有多巴胺涂层的材料表面，并运用PDMS印章法在多巴胺涂层上形成微图形化表面，达到生物分子的可视化的目的。本课题将基于这一表面功能层构建方法，以期望材料能够选择性抑制血小板粘附和促进内皮细胞生长，实现血管支架介入治疗的新突破。
1.2 血管支架材料
目前常用于制作血管支架的材料有医用不锈钢、镍钛合金及镁合金，还有有机高分子材料等。金属支架用于临床后，虽取得不错的效果，但易导致血栓和再狭窄发生，与血管产生不良反应造成血管壁损伤等。早年金属支架年代再狭窄的发生率约20% [7]。针对以上缺点，目前已经研制出覆膜支架及生物材料支架等。理想的金属血管支架应与血管功能的修复时间一致，在生物体的复杂环境下有良好的生物相容性，且具有较好的血管支撑力，同时能抑制内膜增生以减少支架再狭窄。
自从2002年冠脉药物涂层支架的临床应用大大降低了术后再狭窄率，成为冠脉介入治疗的一个新的里程碑。然而，传统药物洗脱支架的架体金属材料无法在体内降解并且还有金属离子释放，易对人体产生危害，同时存在血管支架与人体血管之间机械性能和顺应性的差异，可引起的血管持续性炎症反应和再狭窄。此外，药物洗脱支架的药物和聚合物造成血管内皮损伤修复延迟等不良反应，导致再狭窄和晚期获得性不完全贴壁，这是导致晚期支架血栓形成的主要原因[8]，这也是传统药物涂层支架面临的主要安全问题。最后，支架的药物释放系统难以实现定向治疗，易引起内皮功能障碍等。
由此，冠脉血管支架的技术改良和性能优化是大势所趋，同时更先进的技术也必会涌现，例如新型可吸收降解生物材料支架。
1.3 血液与细胞相容性
1.3.1 材料的血液相容性
血液相容性是血液对外源性物质或抗体产生与之对应的反应。其主要的研究内容有
（1）材料与血浆蛋白的相互作用
当材料植入血管后，血浆蛋白首先在材料表面发生非特异性吸附。在很短的时间内，在材料表面就会产生白蛋白和球蛋白以及各种纤维蛋白原、补体蛋白等蛋白的竞争吸附，进而在材料表面形成复杂的蛋白质吸附层，而当材料表面吸附γ球蛋白、纤维蛋白原是易使血小板粘附表面，产生伪足，从而发生血小板激活聚集，引发凝血[9]。
目 录
1 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2 血管支架材料 2
1.3 血液与细胞相容性 3
1.3.1 材料的血液相容性 3
1.3.2 材料的细胞相容性 3
1.4 肝素与层粘连蛋白的复合 4
1.5 微图形化 5
1.5.1 微图形化技术 5
1.5.2 微图形化技术分类 5
1.6 目的和意义 7
1.7 本课题的研究内容和技术路线 7
2 实验 9
2.1样品、试剂及仪器 9
2.1.1 样品 9
2.1.2 试剂 9
2.1.3 实验仪器 10
2.2 实验过程 10
2.2.1 多巴胺涂层沉积 10
2.2.2 层粘连蛋白/肝素复合物的微图形化表面的制备与固定 11
3 材料学表征的结果与分析 11
3.1傅里叶红外光谱分析（FTIR） 11
3.2 水接触角 12
3.3肝素及RGD密度定量检测结果 13
3.3.1 检测原理 13
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
3.3.2 检测结果和分析 14
3.4 扫描电子显微镜（SEM）表面形貌 15
4 层粘连蛋白/肝素微图形化表面的生物相容性评价 15
4.1血小板粘附实验 15
4.1.1血小板粘附实验步骤和方法 15
4.1.2实验结果和分析 16
4.2 内皮细胞体外培养实验 17
4.2.1 内皮细胞体外培养实验的方法 17
4.2.2 实验结果和分析 18
结 论 20
致 谢 21
参考文献 22
1 绪论
1.1 研究背景
冠心病又称冠状动脉粥样硬化性心脏病，是冠状动脉血管发生病变而引起血管狭窄或阻塞，造成心脏供血供氧不足而导致心肌坏死的心脏病[1]。但冠心病的范围可能更加广泛，还包括炎症、血栓等导致血管狭窄或闭塞的症状。冠心病在我国发病率和死亡率正在增加，且近年来增加速度较为明显。此外，导致冠心病的危险因素水平也在升高[2]。《中国心血管病报告2014》指出，现在全国心血管病患者2.9亿，每5个成人中就有1名患心血管病。而在心血管疾病中，冠心病、高血压和高血脂在我国中老年人群中最为普遍。临床上，动脉粥状硬化一般采用冠状动脉血管支架介入治疗、外科手术（动脉搭桥）和药物治疗[3]。而介入治疗一般采用不锈钢或钛合金等生物医用材料制备的血管支架进行介入治疗。但由于材料表面抗凝血性差和非特异性抗增生药物造成内皮损伤修复延迟以及生物相容性等缺陷，导致血栓和再狭窄的发生。因此，选择一种合适的表面功能层构建方法或表面改性技术，使血管支架材料表面具有选择性抗凝、抑制内膜增生，同时促进内皮再生的能力，是冠心病介入治疗的发展趋势和未来目标。
肝素（Heparin）作为一种抗凝剂，在体内外都有抗凝血作用。所以，如果通过某种生物连接方式使肝素固定到血管支架的材料表面，就能抑制凝血反应（增强抗凝血酶Ⅲ与凝血酶的亲和力，加剧凝血酶的失活，达到抗凝的目的）、抗炎症反应（作用于补体系统的多个环节以及补体蛋白，以抑制系统组织过度激活）和抑制血小板，并增加血管壁的通透性和调控血管新生[4]。受到贝壳类海洋生物分泌的黏附性蛋白质能固定连接到船壳的合金上的启发 ，发现聚多巴胺的粘附机理和性能[5]。结果表明,多巴胺（3,4二羟基苯丙氨酸）可沉积在不同材料基体的表面，包括有机材料和金属材料[5]。其原理是多巴胺的邻苯二酚羟基和氨基基团活性比较高，能与各种材料以共价键和非共价键形成很强的界面结合力。同时发现多巴胺氧化后形成的特殊的邻二醌结构能与含氨基的生物分子发生迈克尔加成反应和西弗碱反应[6]。而肝素不含氨基或巯基，因此无法直接连接到多巴胺涂层。
由此，引入一种中间过渡层层粘连蛋白（laminin, LN)，一种肝素结合性蛋白，含有蛋白质特有的氨基并能调节血管内皮细胞粘附、生长及迁移。
从而肝素和层粘连蛋白的复合物通过迈克尔加成反应和西弗碱反应以及化学键的作用连接到具有多巴胺涂层的材料表面，并运用PDMS印章法在多巴胺涂层上形成微图形化表面，达到生物分子的可视化的目的。本课题将基于这一表面功能层构建方法，以期望材料能够选择性抑制血小板粘附和促进内皮细胞生长，实现血管支架介入治疗的新突破。
1.2 血管支架材料
目前常用于制作血管支架的材料有医用不锈钢、镍钛合金及镁合金，还有有机高分子材料等。金属支架用于临床后，虽取得不错的效果，但易导致血栓和再狭窄发生，与血管产生不良反应造成血管壁损伤等。早年金属支架年代再狭窄的发生率约20% [7]。针对以上缺点，目前已经研制出覆膜支架及生物材料支架等。理想的金属血管支架应与血管功能的修复时间一致，在生物体的复杂环境下有良好的生物相容性，且具有较好的血管支撑力，同时能抑制内膜增生以减少支架再狭窄。
自从2002年冠脉药物涂层支架的临床应用大大降低了术后再狭窄率，成为冠脉介入治疗的一个新的里程碑。然而，传统药物洗脱支架的架体金属材料无法在体内降解并且还有金属离子释放，易对人体产生危害，同时存在血管支架与人体血管之间机械性能和顺应性的差异，可引起的血管持续性炎症反应和再狭窄。此外，药物洗脱支架的药物和聚合物造成血管内皮损伤修复延迟等不良反应，导致再狭窄和晚期获得性不完全贴壁，这是导致晚期支架血栓形成的主要原因[8]，这也是传统药物涂层支架面临的主要安全问题。最后，支架的药物释放系统难以实现定向治疗，易引起内皮功能障碍等。
由此，冠脉血管支架的技术改良和性能优化是大势所趋，同时更先进的技术也必会涌现，例如新型可吸收降解生物材料支架。
1.3 血液与细胞相容性
1.3.1 材料的血液相容性
血液相容性是血液对外源性物质或抗体产生与之对应的反应。其主要的研究内容有
（1）材料与血浆蛋白的相互作用
当材料植入血管后，血浆蛋白首先在材料表面发生非特异性吸附。在很短的时间内，在材料表面就会产生白蛋白和球蛋白以及各种纤维蛋白原、补体蛋白等蛋白的竞争吸附，进而在材料表面形成复杂的蛋白质吸附层，而当材料表面吸附γ球蛋白、纤维蛋白原是易使血小板粘附表面，产生伪足，从而发生血小板激活聚集，引发凝血[9]。
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