纤连蛋白肝素微图形对内皮细胞及血小板行为的影响研究
材料表面的生物相容性不仅与材料表面的生物化学性质有关，也与材料表面的拓扑结构有关。本课题的主要目的是采用微接触印刷术构建纤连蛋白／肝素多功能生物活性微图形，并对制备材料的细胞相容性和血液相容性进行研究。 衰减全反射傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）的结果表明，钛表面成功固定了纤连蛋白和肝素，并且改性后材料的亲水性显著提高；材料表面固定纤连蛋白使血小板粘附的数量增加，而进一步固定肝素形成纤连蛋白/肝素微图形后血小板数量大大减少；同时，微图形表面表现出选择性促进内皮细胞粘附的能力，纤连蛋白区域具有明显促进细胞粘附生长的作用。本课题的研究结果表明，采用微接触印刷术制备的纤连蛋白/肝素微图形同时具有促内皮细胞生长和改善材料血液相容性的作用。关键词纤连蛋白；肝素；微图形；血小板；内皮细胞
目录
1 绪论 1
1.1问题的提出 1
1.2生物材料与生物相容性 1
1.3 影响材料表面生物相容性的因素 1
1.4 血液接触材料多功能表面改性 2
1.5 微接触印刷术 3
1.6 微图形多功能生物活性表面对内皮细胞及血液行为的影响 4
1.7本课题的目的和意义 6
1.8技术路线和研究内容 6
2 实验 7
2.1 材料、试剂与仪器 7
2.2 钛合金样品的准备 8
2.3钛合金表面沉积多巴胺 9
2.4固定纤连蛋白（TiFn）及纤连蛋白肝素复合物（TiFH） 9
2.5 表面化学结构表征 10
2.6表面亲水性表征 10
2.7血小板实验 11
2.8细胞粘附实验 11
3 结果分析与讨论 12
3.1 ATRFTIR分析 12
3.2 表面亲水性 13
3.3血小板黏度实验 14
3.4细胞粘附实验 15
结 论 17
致 谢 18
1 绪论
1.1问题的提出
心血管疾病已经成为人类健康的头号杀手，据统计，我国每年死于心血管疾病的患者约有30万人。性能良好的生物医 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
用材料在心血管疾病治疗领域具有重要的作用，如，用于冠心病心脏支架治疗的钛合金、不锈钢和钴基合金等，然而，植入材料较差的生物相容性给患者带来潜在的威胁，导致其长期应用效果不佳。由于植入材料与人体组织及体液的相互界面作用主要发生在材料表面，因此，材料表面性能对材料植入人体后的性能和功能具有决定性的影响，表面改性也成为生物材料的研究热点。
钛基生物材料由于具有良好的力学性能和耐生理腐蚀性能在生物材料和医疗器械领域具有广泛的应用，如，人工心脏瓣膜、血管支架、人工关节等，然而其较差的表面生物相容性限制了其进一步的应用。研究表明，材料的生物相容性，不仅与材料表面的物理化学性能有关，也与材料表面的拓扑结构有关，并且人体许多组织也具有有序拓扑结构特性，因此，构建生物活性微图形可能从根本上提高材料的生物相容性。
1.2生物材料与生物相容性
生物材料是用于人体组织和器官的诊断、修复或增进其功能的一类高技术材料，即用于取代、修复活组织的天然或人造材料，其作用药物不可替代。生物材料能执行、增进或替换因疾病、损伤等失去的某种功能，而不能恢复缺陷部位。
生物相容性是指生物体和材料之间相互作用，从而产生的各种物理、生物和化学等反应，就是材料植入生物体内与机体的相容程度。生物相容性一般分为血液相容性和细胞相容性。细胞相容性是指材料与生物活体及体液接触后，不会引起细胞、组织功能的下降，组织不会发生炎症、癌变以及排异反应等。血液相容性是指生物材料表面抑制血管内血液形成血栓的能力和生物材料对血液的溶血现象、白细胞暂时性减少、血小板功能降低、补体激活以及功能下降等血液生理功能的影响。
1.3 影响材料表面生物相容性的因素
1.3.1 材料表面亲疏水性
大量的研究表明亲水性的表面比疏水性表面更有利于细胞生长。亲水性表面的吸附作用较弱，吸附可逆，使吸附的蛋白质相对较易实现伸缩运动，进行结构调整（重组）以适合细胞生长的需要；而疏水性表面吸附作用强，吸附不可逆，不易发生结构重组，而且强的相互作用对细胞有丝分裂期间的脱丝不利[1]。但是，到目前为止，其作用的具体机理尚不清楚。
1.3.2 表面电荷与表面能
因为静电吸附，拥有正电荷的材料表面是可以促进细胞粘附的，而因为静电排斥，带有负电荷的材料表面则相反。同时，具有较高表面能的材料表面对细胞的粘附和增殖有促进作用[2]，也就是说细胞的繁殖和生长能力以及粘附数目会随着表面自由能增高而增大[3]。
1.3.3 生物化学基团
材料表面有不同的功能基团就会使细胞行为有相应的不同的效果:一些基团能有效促进细胞粘附并促进其增殖，例如亚氨基、氨基、 酸基等；一些基团只会对细胞粘附产生极小影响，如砜基、醚键、硫酸；还有些基团则对细胞的粘附有着不利的影响，如芳香聚醚类。如果在材料表面上固定不同的生物分子，可以促使内皮细胞增殖，也可以削弱血小板聚集与活化的能力。通常，实验室运用纤连蛋白、细胞生长因子和层粘连蛋白等生物分子促使内皮细胞粘附，而运用肝素、水艇素、白蛋白等进行抗凝。
1.3.4材料表面的拓扑结构
材料表面的拓扑结构，如材料表面的粗糙度、孔洞大小及其分布、沟槽的深度和宽度、纤维的粗细等等，都会对细胞形态、粘附、铺展、繁殖、及活性有着重要的影响。其中材料的刻槽、开孔结构、纹理结构对细胞相容性的影响已有较多研究。
1.4 血液接触材料多功能表面改性
赋予材料多功能生物活性，使其具有对血液、周围组织、细胞进行生物调控的能力近年来成为血管内植入材料的研究热点和难点，在材料表面固定两种或多种生物活性分子是多功能生物活性表面构建的常用方法。聚乙二醇（PEG）具有优异的抑制蛋白吸附能力，在固定PEG的基础上进一步固定抗凝血酶肝素复合物、玉米胰蛋白酶抑制剂（CTI）或水蛭素等可以发挥两种分子的抗凝血生物活性[46]，从多个途径抑制凝血发生。利用肝素可以与纤连蛋白形成复合物的特点，可以在自组装氨基硅烷的钛材表面静电吸附或共固定肝素纤连蛋白复合物，同时赋予材料表面抗凝生物活性和诱导内皮形成能力，用于血管内植入材料的表面改性。采用层层自组装（LBL）技术在钛表面构建由多种生物活性分子组成的复合多层结构也可以赋予材料多功能生物活性，同时提高材料的抗凝血性能及促内皮细胞生长性能。随着对材料与血液及细胞的界面相互作用机理认识的不断深入，具有细胞选择性的原位内皮化抗凝血表面改性成为近年来多功能表面改性的研究热点，REDV（精氨酸谷氨酸天冬氨酸缬氨酸）是一种具有选择性吸附并促进内皮细胞生长的特异性多肽物质，在多巴胺固定的钛材表面聚合接枝聚乙二醇甲基丙烯酸后进一步接枝REDV，可以同时发挥聚乙二醇的抗凝血作用及REDV特异性诱导内皮形成的协同作用，而采用REDV修饰的高分子材料包覆雷帕霉素用于药物洗脱支架则可以抑制平滑肌细胞增殖并获得内皮细胞选择性粘附能力。为了能够从多个途径抑制凝血的发生，潘长江课题组以双官能团PEG分子作为连接分子，在自组装氨基硅烷的钛基体上依次接枝PEG和磷脂胆碱、肝素或白蛋白，发挥两种分子的抗凝血功能[79]；为了进一步促进内皮细胞的生长，他们在接枝PEG的基础上进一步接枝胶原蛋白实现了抗凝血和促内皮细胞生长的双重功能。
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1 绪论 1
1.1问题的提出 1
1.2生物材料与生物相容性 1
1.3 影响材料表面生物相容性的因素 1
1.4 血液接触材料多功能表面改性 2
1.5 微接触印刷术 3
1.6 微图形多功能生物活性表面对内皮细胞及血液行为的影响 4
1.7本课题的目的和意义 6
1.8技术路线和研究内容 6
2 实验 7
2.1 材料、试剂与仪器 7
2.2 钛合金样品的准备 8
2.3钛合金表面沉积多巴胺 9
2.4固定纤连蛋白（TiFn）及纤连蛋白肝素复合物（TiFH） 9
2.5 表面化学结构表征 10
2.6表面亲水性表征 10
2.7血小板实验 11
2.8细胞粘附实验 11
3 结果分析与讨论 12
3.1 ATRFTIR分析 12
3.2 表面亲水性 13
3.3血小板黏度实验 14
3.4细胞粘附实验 15
结 论 17
致 谢 18
1 绪论
1.1问题的提出
心血管疾病已经成为人类健康的头号杀手，据统计，我国每年死于心血管疾病的患者约有30万人。性能良好的生物医 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
用材料在心血管疾病治疗领域具有重要的作用，如，用于冠心病心脏支架治疗的钛合金、不锈钢和钴基合金等，然而，植入材料较差的生物相容性给患者带来潜在的威胁，导致其长期应用效果不佳。由于植入材料与人体组织及体液的相互界面作用主要发生在材料表面，因此，材料表面性能对材料植入人体后的性能和功能具有决定性的影响，表面改性也成为生物材料的研究热点。
钛基生物材料由于具有良好的力学性能和耐生理腐蚀性能在生物材料和医疗器械领域具有广泛的应用，如，人工心脏瓣膜、血管支架、人工关节等，然而其较差的表面生物相容性限制了其进一步的应用。研究表明，材料的生物相容性，不仅与材料表面的物理化学性能有关，也与材料表面的拓扑结构有关，并且人体许多组织也具有有序拓扑结构特性，因此，构建生物活性微图形可能从根本上提高材料的生物相容性。
1.2生物材料与生物相容性
生物材料是用于人体组织和器官的诊断、修复或增进其功能的一类高技术材料，即用于取代、修复活组织的天然或人造材料，其作用药物不可替代。生物材料能执行、增进或替换因疾病、损伤等失去的某种功能，而不能恢复缺陷部位。
生物相容性是指生物体和材料之间相互作用，从而产生的各种物理、生物和化学等反应，就是材料植入生物体内与机体的相容程度。生物相容性一般分为血液相容性和细胞相容性。细胞相容性是指材料与生物活体及体液接触后，不会引起细胞、组织功能的下降，组织不会发生炎症、癌变以及排异反应等。血液相容性是指生物材料表面抑制血管内血液形成血栓的能力和生物材料对血液的溶血现象、白细胞暂时性减少、血小板功能降低、补体激活以及功能下降等血液生理功能的影响。
1.3 影响材料表面生物相容性的因素
1.3.1 材料表面亲疏水性
大量的研究表明亲水性的表面比疏水性表面更有利于细胞生长。亲水性表面的吸附作用较弱，吸附可逆，使吸附的蛋白质相对较易实现伸缩运动，进行结构调整（重组）以适合细胞生长的需要；而疏水性表面吸附作用强，吸附不可逆，不易发生结构重组，而且强的相互作用对细胞有丝分裂期间的脱丝不利[1]。但是，到目前为止，其作用的具体机理尚不清楚。
1.3.2 表面电荷与表面能
因为静电吸附，拥有正电荷的材料表面是可以促进细胞粘附的，而因为静电排斥，带有负电荷的材料表面则相反。同时，具有较高表面能的材料表面对细胞的粘附和增殖有促进作用[2]，也就是说细胞的繁殖和生长能力以及粘附数目会随着表面自由能增高而增大[3]。
1.3.3 生物化学基团
材料表面有不同的功能基团就会使细胞行为有相应的不同的效果:一些基团能有效促进细胞粘附并促进其增殖，例如亚氨基、氨基、 酸基等；一些基团只会对细胞粘附产生极小影响，如砜基、醚键、硫酸；还有些基团则对细胞的粘附有着不利的影响，如芳香聚醚类。如果在材料表面上固定不同的生物分子，可以促使内皮细胞增殖，也可以削弱血小板聚集与活化的能力。通常，实验室运用纤连蛋白、细胞生长因子和层粘连蛋白等生物分子促使内皮细胞粘附，而运用肝素、水艇素、白蛋白等进行抗凝。
1.3.4材料表面的拓扑结构
材料表面的拓扑结构，如材料表面的粗糙度、孔洞大小及其分布、沟槽的深度和宽度、纤维的粗细等等，都会对细胞形态、粘附、铺展、繁殖、及活性有着重要的影响。其中材料的刻槽、开孔结构、纹理结构对细胞相容性的影响已有较多研究。
1.4 血液接触材料多功能表面改性
赋予材料多功能生物活性，使其具有对血液、周围组织、细胞进行生物调控的能力近年来成为血管内植入材料的研究热点和难点，在材料表面固定两种或多种生物活性分子是多功能生物活性表面构建的常用方法。聚乙二醇（PEG）具有优异的抑制蛋白吸附能力，在固定PEG的基础上进一步固定抗凝血酶肝素复合物、玉米胰蛋白酶抑制剂（CTI）或水蛭素等可以发挥两种分子的抗凝血生物活性[46]，从多个途径抑制凝血发生。利用肝素可以与纤连蛋白形成复合物的特点，可以在自组装氨基硅烷的钛材表面静电吸附或共固定肝素纤连蛋白复合物，同时赋予材料表面抗凝生物活性和诱导内皮形成能力，用于血管内植入材料的表面改性。采用层层自组装（LBL）技术在钛表面构建由多种生物活性分子组成的复合多层结构也可以赋予材料多功能生物活性，同时提高材料的抗凝血性能及促内皮细胞生长性能。随着对材料与血液及细胞的界面相互作用机理认识的不断深入，具有细胞选择性的原位内皮化抗凝血表面改性成为近年来多功能表面改性的研究热点，REDV（精氨酸谷氨酸天冬氨酸缬氨酸）是一种具有选择性吸附并促进内皮细胞生长的特异性多肽物质，在多巴胺固定的钛材表面聚合接枝聚乙二醇甲基丙烯酸后进一步接枝REDV，可以同时发挥聚乙二醇的抗凝血作用及REDV特异性诱导内皮形成的协同作用，而采用REDV修饰的高分子材料包覆雷帕霉素用于药物洗脱支架则可以抑制平滑肌细胞增殖并获得内皮细胞选择性粘附能力。为了能够从多个途径抑制凝血的发生，潘长江课题组以双官能团PEG分子作为连接分子，在自组装氨基硅烷的钛基体上依次接枝PEG和磷脂胆碱、肝素或白蛋白，发挥两种分子的抗凝血功能[79]；为了进一步促进内皮细胞的生长，他们在接枝PEG的基础上进一步接枝胶原蛋白实现了抗凝血和促内皮细胞生长的双重功能。
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