基于荧光高光谱成像技术的生物检测研究【字数：13338】
摘 要随着社会的进步，科学技术的发展，人们对生物领域的探索和利用变得越来越深入。随着人们对生物的认识的深化，越来越多的技术应用于生物领域，并逐渐成熟化。荧光高光谱成像技术采用激光作为激发光源，通过激发物质的荧光来获取空间上每一点的荧光光谱，荧光光谱都包含大量的数据可以从中获取丰富的有价值的信息。利用荧光高光谱成像技术，可以开展病理切片与细菌的鉴别，判断分析的研究。该研究搭建了一个成像光谱仪，并结合短波长的线状光源与荧光检测元件建立了一套荧光高光谱检测系统，并针对两类切片（病理切片，细菌）进行快速光谱检测与分析。上述待测样品制成切片，通过成像光谱仪的推扫式扫描获得样品的荧光高光谱数据。在实际扫描过程中，为了分析系统对于细菌的探测效果，检测了两种不同细菌（大肠杆菌，酸奶分离菌）并分析两者光谱的差异。检验了系统了对病理切片的分析效果，首先对四种病理切片的样品进行扫描，获得其荧光高光谱数据，并分析其光谱数据特征，以此作为标准样品数据用于切片的判断工作中。然后对混合细菌进行扫描，得到混合样品的荧光高光谱数据，利用主要成分分析法对混合细菌样品数据进行降维，进而使用K均值聚类算法对降维后的数据进行聚类，从而得到混合细菌样品的区域分布。实验结果表明，荧光高光谱成像系统可以识别出不同的细菌，且同时完成病理切片种类的判断。该应用可用于生物领域的检测。
目 录
1绪论 1
1.1成像光谱仪的发展 1
1.1.1成像光谱仪国外发展历史 1
1.1.2成像光谱仪国内发展历史 2
1.1.3成像光谱仪发展趋势 2
2荧光光谱理论简介 3
2.1荧光产生的基本原理 3
2.2荧光光谱简介 4
2.2.1荧光光谱的类型 4
2.2.2荧光光谱的特征 5
3成像光谱仪设计 6
3.1成像光谱仪系统介绍 6
3.1.1成像光谱仪的成像系统 6
3.1.2成像光谱仪的光学系统 7
3.1.3成像光谱仪的分光系统 8
3.2成像光谱系统结构与器件选择 11
3.2.1成像光谱仪系统整体系统选择 11
3.3成像光谱仪检测系统控制程序 12 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
3.4成像光谱仪的波长校准 14
4细菌荧光分布分类与病理切片的探测实验 17
4.1成像光谱数据处理方法 17
4.1.1成像光谱数据形式 17
4.1.2光谱数据预处理 17
4.1.3成像光谱数据的降维及聚类 18
4.2实验材料准备及实验过程描述 19
4.2.1实验材料的准备 19
4.2.2实验过程 20
4.3结果与讨论 21
4.3.1病理切片的数据分析 21
4.3.2单一细菌光谱数据分析 22
4.3.3混合细菌的数据分析 23
5总结与展望 25
参考文献 26
致谢 27
1绪论
由于受到衍射极限的限制，传统显微镜的分辨阈值无法获得进一步提高。因此，诸多显微镜例如扫描电镜、原子力显微镜、激光共聚焦显微镜等超分辨显微系统相继被开发出来，为的就是更好探究微观世界。采用这些超分辨显微系统能够获得纳米级别的显微图像，甚至还能获得样品的三维信息。但是仅仅在空间分辨率上的提升已经不能满足当代科研的需求，只能提供样品形貌信息的显微镜不符合时代发展。因此能够同时提供样品形貌和光谱信息的高光谱显微成像技术成为当前研究的热点之一，并广泛应用于各个科研检测领域。
高光谱成像技术，尤其是荧光成像技术，由于具有全波段光谱连续，能识别样品不同化学组成的特点。逐渐被应用于各个领域。研究表明，波段比算法具有检测方便，还能有效增强不同成分之间差异的优点，还能提供许多无法从单波段或者图像上的到的独特信息。本文主要研究目的使用高光谱荧光成像技术来检测病理切片与细菌，并分析出有用信息。
1.1成像光谱仪的发展
成像光谱仪是一种能够在同一时间获取图像以及光谱信息的仪器，它能够在获取物体的空间位置信息的同时，对每一个传感器上的像元获取其对应的光谱信息，从而实现空间信息与光谱信息的统一。其基本原理是在扫描成像原理的基础上，将成像辐射的波段细分成更精确，更狭窄的多个波段然后同时成像，从而获得同一景物的多个光谱波段图像[1]。其研究开始于上个世纪80年代，随着技术不断进步，成像光谱技术也在不断发展。
1.1.1成像光谱仪国外发展历史
在20世纪80年代初，第一台成像的研究光谱仪由美国JPL研制成功，名为AIS。其能在0.92.4um的红外波段范围获取128个波段，成为了成像光谱仪的研究的开端[2]。随着各种技术的不断完善，成像光谱仪的各种参数也做的越来越高，应用范围越来越广，其中运用最广泛的就是成为了星载或机载设备，获取了大量的环境数据，为其他学科的研究提供了宝贵的素材。
AIS系列的成像光谱仪成功的应用在多个地质研究领域，但受限于二维探测器的像素有限，其发展受到了一定的阻碍。在1987年，第二代成像光谱仪AVIRIS在美国宇航局喷气推进实验室研制成功。这是一台可见红外光成像光谱仪，覆盖的波长范围为0.4um2.5um[3]。与AIS相比，其在各个方面都有了很大的改进，并为科学研究提供了大量的数据图片。同期，加拿大公司研制出了第一种商业上使用的机载高光谱扫描仪CASI,其波段范围在0.40.9um,有288个波段，瞬时视场为1.2mrad。
后续，各种性能越来越高的成像光谱仪被研制出来并送上卫星。1997年，第一颗载有高光谱成像仪的卫星成功发射，其装载了HIS和LEISA 两台高光谱成像仪。2000年，美国发射卫星地球观测1号(E01) ，搭载了可见近红外短波推扫高光谱成像仪Hyperion,其包含了0.40.1um和0.92.5um两种光谱范围，瞬时视场43urad,波段数220[4]。美国空军实验室MightySatII.1卫星搭载了第一台傅里叶干涉分光技术的高光谱成像仪，在0.451.05um的光谱范围内有150个通道，其分辨率4nm。德国DASA研制的HRIS设计于搭载在Envisat卫星上，覆盖光谱范围0.452.35um，有205个通道。
1.1.2成像光谱仪国内发展历史
20世纪90年代初，国内成像光谱仪的研究工作开始起步。中科院上海技术物理研究所最先开展了关于机载成像光谱仪和星载中分辨率成像光谱仪的研制，首先研制出了PHI高光谱成像仪[5]。在2002年，神舟三号载人航天飞船发射成功，就携带了中国科学院上海技术物理研究所研制的星载中分辨率成像光谱仪，并且该设备成功运用于新一代气象卫星”风云三号”[6]。2007年，“嫦娥一号”探月卫星搭载了国内第一台傅里叶干涉成像光谱仪，成功实现对月球的探测[7]。目前，我国许多相关研究所仍在进行高光谱技术的研究，并为新技术的发展做出了重要的贡献。
1.1.3成像光谱仪发展趋势
目前，机载与星载光谱仪的发展已经日渐成熟，而为了应对更加多变的情况，并将成像光谱技术应用于更广阔的场景，成像光谱仪小型化已经成为了其发展的必然趋势。近年来，已经有一些小型成像光谱仪出现了，如美国Surface Optics公司研制的SOC系列的高光谱成像仪等。随着技术的发展与更新，小型光谱仪技术会越来越成熟，并推动各个领域的发展。
目 录
1绪论 1
1.1成像光谱仪的发展 1
1.1.1成像光谱仪国外发展历史 1
1.1.2成像光谱仪国内发展历史 2
1.1.3成像光谱仪发展趋势 2
2荧光光谱理论简介 3
2.1荧光产生的基本原理 3
2.2荧光光谱简介 4
2.2.1荧光光谱的类型 4
2.2.2荧光光谱的特征 5
3成像光谱仪设计 6
3.1成像光谱仪系统介绍 6
3.1.1成像光谱仪的成像系统 6
3.1.2成像光谱仪的光学系统 7
3.1.3成像光谱仪的分光系统 8
3.2成像光谱系统结构与器件选择 11
3.2.1成像光谱仪系统整体系统选择 11
3.3成像光谱仪检测系统控制程序 12 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
3.4成像光谱仪的波长校准 14
4细菌荧光分布分类与病理切片的探测实验 17
4.1成像光谱数据处理方法 17
4.1.1成像光谱数据形式 17
4.1.2光谱数据预处理 17
4.1.3成像光谱数据的降维及聚类 18
4.2实验材料准备及实验过程描述 19
4.2.1实验材料的准备 19
4.2.2实验过程 20
4.3结果与讨论 21
4.3.1病理切片的数据分析 21
4.3.2单一细菌光谱数据分析 22
4.3.3混合细菌的数据分析 23
5总结与展望 25
参考文献 26
致谢 27
1绪论
由于受到衍射极限的限制，传统显微镜的分辨阈值无法获得进一步提高。因此，诸多显微镜例如扫描电镜、原子力显微镜、激光共聚焦显微镜等超分辨显微系统相继被开发出来，为的就是更好探究微观世界。采用这些超分辨显微系统能够获得纳米级别的显微图像，甚至还能获得样品的三维信息。但是仅仅在空间分辨率上的提升已经不能满足当代科研的需求，只能提供样品形貌信息的显微镜不符合时代发展。因此能够同时提供样品形貌和光谱信息的高光谱显微成像技术成为当前研究的热点之一，并广泛应用于各个科研检测领域。
高光谱成像技术，尤其是荧光成像技术，由于具有全波段光谱连续，能识别样品不同化学组成的特点。逐渐被应用于各个领域。研究表明，波段比算法具有检测方便，还能有效增强不同成分之间差异的优点，还能提供许多无法从单波段或者图像上的到的独特信息。本文主要研究目的使用高光谱荧光成像技术来检测病理切片与细菌，并分析出有用信息。
1.1成像光谱仪的发展
成像光谱仪是一种能够在同一时间获取图像以及光谱信息的仪器，它能够在获取物体的空间位置信息的同时，对每一个传感器上的像元获取其对应的光谱信息，从而实现空间信息与光谱信息的统一。其基本原理是在扫描成像原理的基础上，将成像辐射的波段细分成更精确，更狭窄的多个波段然后同时成像，从而获得同一景物的多个光谱波段图像[1]。其研究开始于上个世纪80年代，随着技术不断进步，成像光谱技术也在不断发展。
1.1.1成像光谱仪国外发展历史
在20世纪80年代初，第一台成像的研究光谱仪由美国JPL研制成功，名为AIS。其能在0.92.4um的红外波段范围获取128个波段，成为了成像光谱仪的研究的开端[2]。随着各种技术的不断完善，成像光谱仪的各种参数也做的越来越高，应用范围越来越广，其中运用最广泛的就是成为了星载或机载设备，获取了大量的环境数据，为其他学科的研究提供了宝贵的素材。
AIS系列的成像光谱仪成功的应用在多个地质研究领域，但受限于二维探测器的像素有限，其发展受到了一定的阻碍。在1987年，第二代成像光谱仪AVIRIS在美国宇航局喷气推进实验室研制成功。这是一台可见红外光成像光谱仪，覆盖的波长范围为0.4um2.5um[3]。与AIS相比，其在各个方面都有了很大的改进，并为科学研究提供了大量的数据图片。同期，加拿大公司研制出了第一种商业上使用的机载高光谱扫描仪CASI,其波段范围在0.40.9um,有288个波段，瞬时视场为1.2mrad。
后续，各种性能越来越高的成像光谱仪被研制出来并送上卫星。1997年，第一颗载有高光谱成像仪的卫星成功发射，其装载了HIS和LEISA 两台高光谱成像仪。2000年，美国发射卫星地球观测1号(E01) ，搭载了可见近红外短波推扫高光谱成像仪Hyperion,其包含了0.40.1um和0.92.5um两种光谱范围，瞬时视场43urad,波段数220[4]。美国空军实验室MightySatII.1卫星搭载了第一台傅里叶干涉分光技术的高光谱成像仪，在0.451.05um的光谱范围内有150个通道，其分辨率4nm。德国DASA研制的HRIS设计于搭载在Envisat卫星上，覆盖光谱范围0.452.35um，有205个通道。
1.1.2成像光谱仪国内发展历史
20世纪90年代初，国内成像光谱仪的研究工作开始起步。中科院上海技术物理研究所最先开展了关于机载成像光谱仪和星载中分辨率成像光谱仪的研制，首先研制出了PHI高光谱成像仪[5]。在2002年，神舟三号载人航天飞船发射成功，就携带了中国科学院上海技术物理研究所研制的星载中分辨率成像光谱仪，并且该设备成功运用于新一代气象卫星”风云三号”[6]。2007年，“嫦娥一号”探月卫星搭载了国内第一台傅里叶干涉成像光谱仪，成功实现对月球的探测[7]。目前，我国许多相关研究所仍在进行高光谱技术的研究，并为新技术的发展做出了重要的贡献。
1.1.3成像光谱仪发展趋势
目前，机载与星载光谱仪的发展已经日渐成熟，而为了应对更加多变的情况，并将成像光谱技术应用于更广阔的场景，成像光谱仪小型化已经成为了其发展的必然趋势。近年来，已经有一些小型成像光谱仪出现了，如美国Surface Optics公司研制的SOC系列的高光谱成像仪等。随着技术的发展与更新，小型光谱仪技术会越来越成熟，并推动各个领域的发展。
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