基于光片显微镜的检测应用【字数：11081】
20世纪末，研究人员就已经在理论层面上提出了具有超高分辨率的荧光成像技术，并将其应用在实际生活中。近年来，荧光成像技术得到不断地发展，尤其是在工业检测方面，光学显微镜已发展成各种类型，可广泛应用于铸造、冶炼、热处理等各种研究以及原材料检验或材料处理分析。不同于传统光学显微镜设计原理，光片荧光显微镜在很大程度上降低了光对样品的光毒性和光漂白，并且对样品的一个薄层进行成像，配合使用高量子效率的CCD或SCMOS探测器，是大视野、高速、高分辨率三维物体显微成像的理想工具。本文首先介绍了光片荧光显微镜的发展历史及其研究现状，以人体头发、硅片以及手机壳作为实验样品，同时采用激光三角测距的方法对其进行定量计算，旨在验证基于光片显微镜定量计算的可行性。这个方法还提供了在微米量级分辨率上指纹3D可视化的机会，对于生物学领域样品的三维形貌检测有一定的参考意义。
目 录
1. 引言 1
1.1 光片显微镜历史发展 1
1.2 发展现状 2
2. 光片显微镜概述 4
2.1 基本原理 4
2.2 基本结构 5
2.2.1 照明模块 5
2.2.2 成像模块 6
2.2.3 运动单元 7
2.2.4 控制单元 8
2.3 光片的产生 9
3. 激光三角测距法 10
3.1 基本原理 10
3.2 系统优势 11
4. 基于LSM的三维表面重构及其定量计算应用 12
4.1 主要思路 12
4.2 系统搭建 12
4.2.1 照明模块和成像模块的安装 12
4.2.2 电动位移平台的设置 12
4.2.3 相机预览和拍照设置 13
4.3 系统标定 13
4.3.1 标定过程 13
4.3.2 标定分析 14
4.4 实验过程 16
4.4.1 测量人体头发，验证系统的可行性 16
4.4.2 测量硅片表面的沟壑形貌并计算沟壑深度 18
4.4.3 测量手机壳侧边曲率 19
4.5 小结 20 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
5. 总结与展望 22
5.1 全文总结 22
5.2 对未来研究展望 22
参考文献 23
致谢 24
1. 引言
1.1 光片显微镜历史发展
从17世纪中叶，人类就开始了显微镜的研究之路，这一悠久的历史告诉我们：人的本性就是要不断探测微观世界。1665年，英国科学家胡克通过自制显微镜观察细小物体，首次在其出版的《显微图鉴》中提出“细胞”的概念。自此，显微镜得到不断的发展，变成了科学研究和医学研究中的重要利器，越来越凸显其在科研领域的重要性。
人类发展经历了蒸汽时代、电气时代以及如今的信息时代，在现今的军事、教育、生活等个个方面的发展都已经逐渐实现数字化。显微镜也突破了传统意义上的使用限制，成为集图像采集、数据处理和数据存储等功能于一体的全新平台。
光片照明显微镜成像的原理起源于1903年，可以追溯到由Zsigmondy,R.与Siedentopf,H.发明的“Ultramicroscopy”[1]（超级显微镜），如下图所示。其基本原理是将太阳光或汞灯光束用透镜聚焦，在焦点处形成一薄片光，从侧面照明样品，而在垂直方向采用明场显微镜进行观察。这样仅有被照明层面的样品会被显微镜观测到，就可以把三维立体图形分解成一个个层面图像以便观测分析。利用该种图像采集原理构造的显微镜能够观测到光轴方向尺度明显小于显微镜分辨率的微小粒子，极大地提高了显微镜的分辨率。1925年，Zsigmondy凭借该发现获得诺贝尔奖。但由于时代的局限性，当时照明光片的光学性能以及当时显微镜的成像质量不高，该技术在工业成像上未得到大范围推广[2]。
图1.1 超级显微镜原理图
20世纪后半个世纪，研究人员将激光技术与显微成像技术结合。激光扫描共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源，对标本内焦平面上的每一点进行线扫描[3]，照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的焦平面上的点，同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，大大提高了系统的分辨率同时克服了传统显微镜成像不清楚的缺点。该系统的原理图如下图所示[45]。
图1.2 激光共聚焦简化原理图
在荧光显微镜中，活细胞的损失、对生物体产生的毒性或漂白效应以及所获得的信息的减少是迫切需要解决的主要问题。在研究活体样品时，研究人员观察活体细胞的时间越长,他们获得的关于活细胞和组织的信息就越多。因此，将光负荷降低到最低程度的成像系统成为荧光显微镜大范围推广所需解决的首要问题。Zeiss公司最新的代表产品lightsheet Z.1型激光片层扫描显微镜将荧光激发和荧光探测分为两个独立的光路，而且激发光轴和探测光轴互相垂直，工作时每次仅照亮样本一片很薄的区域。不仅能对细小样品进行扫描，该系统也能够对大型样品进行切割扫描。在对大样品进行检测分析时，系统的光负荷很小，时间分辨率极高，且该系统可以在30天内从不同角度对活体对象进行三维观测。但是，需要解决的最大问题是分辨率，阿贝分辨率极限原理是阻碍显微镜分辨率进一步提高的主要因素。2006年，Eric Betzing先生及其同事发明了PALM ,一种光激活定位显微技术，利用光来控制荧光照射在细胞上的转换以避免阿贝分辨率极限,并实现比磁限约低10倍即200nm的分辨率[67]。
1.2 发展现状
近些年来，得益于生物荧光标记技术以及激光的发展，光片显微技术发展十分迅速。基于光切法原理，上海工程技术大学研究人员利用光学显微镜获取工件表面图像，同时在显微目镜前加入摄像头，将采集的图像导入到计算机中，通过图形用户界面的操作测定出工件表面的粗糙度，可提高测量精确度且节省大量计算时间。中国科学院西安光学精密机械研究所瞬态光学与光子技术国家重点实验室超分辨成像团队成功研制双光子微发激光扫描实时立体显微镜，首次把基于双目视觉的立体显微方法和高分辨率双光子激发激光扫描荧光显微技术结合在一起，实现了对三维荧光样品的高速立体成像。在金属材料研发领域，科研人员利用激光共聚焦显微镜对金属金相组织进行观察，能清楚观察到粒状贝氏体零散地分布在基体上，同时可利用软件工具在微米量级上对贝氏体的尺寸进行测量。
目 录
1. 引言 1
1.1 光片显微镜历史发展 1
1.2 发展现状 2
2. 光片显微镜概述 4
2.1 基本原理 4
2.2 基本结构 5
2.2.1 照明模块 5
2.2.2 成像模块 6
2.2.3 运动单元 7
2.2.4 控制单元 8
2.3 光片的产生 9
3. 激光三角测距法 10
3.1 基本原理 10
3.2 系统优势 11
4. 基于LSM的三维表面重构及其定量计算应用 12
4.1 主要思路 12
4.2 系统搭建 12
4.2.1 照明模块和成像模块的安装 12
4.2.2 电动位移平台的设置 12
4.2.3 相机预览和拍照设置 13
4.3 系统标定 13
4.3.1 标定过程 13
4.3.2 标定分析 14
4.4 实验过程 16
4.4.1 测量人体头发，验证系统的可行性 16
4.4.2 测量硅片表面的沟壑形貌并计算沟壑深度 18
4.4.3 测量手机壳侧边曲率 19
4.5 小结 20 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
5. 总结与展望 22
5.1 全文总结 22
5.2 对未来研究展望 22
参考文献 23
致谢 24
1. 引言
1.1 光片显微镜历史发展
从17世纪中叶，人类就开始了显微镜的研究之路，这一悠久的历史告诉我们：人的本性就是要不断探测微观世界。1665年，英国科学家胡克通过自制显微镜观察细小物体，首次在其出版的《显微图鉴》中提出“细胞”的概念。自此，显微镜得到不断的发展，变成了科学研究和医学研究中的重要利器，越来越凸显其在科研领域的重要性。
人类发展经历了蒸汽时代、电气时代以及如今的信息时代，在现今的军事、教育、生活等个个方面的发展都已经逐渐实现数字化。显微镜也突破了传统意义上的使用限制，成为集图像采集、数据处理和数据存储等功能于一体的全新平台。
光片照明显微镜成像的原理起源于1903年，可以追溯到由Zsigmondy,R.与Siedentopf,H.发明的“Ultramicroscopy”[1]（超级显微镜），如下图所示。其基本原理是将太阳光或汞灯光束用透镜聚焦，在焦点处形成一薄片光，从侧面照明样品，而在垂直方向采用明场显微镜进行观察。这样仅有被照明层面的样品会被显微镜观测到，就可以把三维立体图形分解成一个个层面图像以便观测分析。利用该种图像采集原理构造的显微镜能够观测到光轴方向尺度明显小于显微镜分辨率的微小粒子，极大地提高了显微镜的分辨率。1925年，Zsigmondy凭借该发现获得诺贝尔奖。但由于时代的局限性，当时照明光片的光学性能以及当时显微镜的成像质量不高，该技术在工业成像上未得到大范围推广[2]。
图1.1 超级显微镜原理图
20世纪后半个世纪，研究人员将激光技术与显微成像技术结合。激光扫描共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源，对标本内焦平面上的每一点进行线扫描[3]，照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的焦平面上的点，同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，大大提高了系统的分辨率同时克服了传统显微镜成像不清楚的缺点。该系统的原理图如下图所示[45]。
图1.2 激光共聚焦简化原理图
在荧光显微镜中，活细胞的损失、对生物体产生的毒性或漂白效应以及所获得的信息的减少是迫切需要解决的主要问题。在研究活体样品时，研究人员观察活体细胞的时间越长,他们获得的关于活细胞和组织的信息就越多。因此，将光负荷降低到最低程度的成像系统成为荧光显微镜大范围推广所需解决的首要问题。Zeiss公司最新的代表产品lightsheet Z.1型激光片层扫描显微镜将荧光激发和荧光探测分为两个独立的光路，而且激发光轴和探测光轴互相垂直，工作时每次仅照亮样本一片很薄的区域。不仅能对细小样品进行扫描，该系统也能够对大型样品进行切割扫描。在对大样品进行检测分析时，系统的光负荷很小，时间分辨率极高，且该系统可以在30天内从不同角度对活体对象进行三维观测。但是，需要解决的最大问题是分辨率，阿贝分辨率极限原理是阻碍显微镜分辨率进一步提高的主要因素。2006年，Eric Betzing先生及其同事发明了PALM ,一种光激活定位显微技术，利用光来控制荧光照射在细胞上的转换以避免阿贝分辨率极限,并实现比磁限约低10倍即200nm的分辨率[67]。
1.2 发展现状
近些年来，得益于生物荧光标记技术以及激光的发展，光片显微技术发展十分迅速。基于光切法原理，上海工程技术大学研究人员利用光学显微镜获取工件表面图像，同时在显微目镜前加入摄像头，将采集的图像导入到计算机中，通过图形用户界面的操作测定出工件表面的粗糙度，可提高测量精确度且节省大量计算时间。中国科学院西安光学精密机械研究所瞬态光学与光子技术国家重点实验室超分辨成像团队成功研制双光子微发激光扫描实时立体显微镜，首次把基于双目视觉的立体显微方法和高分辨率双光子激发激光扫描荧光显微技术结合在一起，实现了对三维荧光样品的高速立体成像。在金属材料研发领域，科研人员利用激光共聚焦显微镜对金属金相组织进行观察，能清楚观察到粒状贝氏体零散地分布在基体上，同时可利用软件工具在微米量级上对贝氏体的尺寸进行测量。
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