[参考文献]中度嗜盐菌中的一种新型耐有机溶剂蛋白酶及其在离子液体中的行为表征的描述
中度嗜盐菌中的一种新型耐有机溶剂蛋白酶及其在离子液体中的行为表征的描述
摘要:胞外蛋白酶是从一株新的中度嗜盐菌Salinivibrio SP.菌株MS-7通过丙酮沉淀法（40-80％）步骤和DEAE—纤维素阴离子交换柱层析的结合而纯化得到的。
酶的动力学参数显示的130单位/毫克和 1.14毫克/毫升的Vmax和Km，分别是用酪蛋白作为底物。21-kDa蛋白酶的生物化学特性的温度和pH最适点分别为50℃和8.0。苯甲基磺酰氟，Pefabloc SC，胰凝乳蛋白酶抑制剂和EDTA对该酶具有强烈的抑制作用，这表明它属于类丝氨酸金属蛋白酶。有趣的是，Ba2 +和Ca2 +（2 g/mol）能较强的增强酶的活性，而Fe2 +和Mg2 +对酶的活性中等而Zn2 +，Ni2 +和Hg2 +则使酶的活性减少。不同的logP对纯化蛋白酶的有机溶剂的影响表现为在甲苯，乙酸乙酯，氯仿和在10和50％（V / V）的正己烷中有完整的稳定性即使在50％的DMSO（二甲基亚砜）和乙醇中也具有中等稳定性。MS-7蛋白酶在3咪唑鎓系离子液体的行为，在这些绿色溶剂体系，特别是在1 - 己基-3 - 甲基咪唑鎓六氟磷酸盐（[C6MIM] [PF 6]）中表现出适当的活性。纯化的蛋白酶与其他先前报道的蛋白酶相比较表明，菌株MS-7隐秘的新型耐有机溶剂的蛋白酶在有机溶剂中和咪唑鎓系离子液体中具有杰出的活性，这可能会被应用在工业生物技术的低水合成部。
*查看完整论文请+Q: 351916072
关键词 Salinivibrio sp.菌株 MS-7 离子液体 中度嗜盐菌 有机溶剂 蛋白酶
介绍 微生物蛋白酶因为在生理过程中的重要作用[1]，广泛的生化多样性，他们的分析和工业应用[2,3]，和可行性批量生产以及遗传操作简易性吸引了世界各地研究人员的关注。蛋白酶在洗涤剂中，皮革，丝绸，面包，豆制品加工，肉类嫩化，和酿酒行业的应用是有据可查的[4,5]。另一方面，在有机溶剂和离子液体中的蛋白酶的操作是生物技术和生物化学的一个有趣的显影区域[6]。蛋白酶可以催化合成反应，这是水解的逆反应，而且转酯化反应用合适的立体定向性和不需要以化学合成的方法保护侧链 [7]。然而，在有机介质中蛋白酶使用于肽，酯，和其它生物活性有机分子的合成受到这些酶在有机溶剂存在下的不稳定性限制。在过去20多年中广泛的讨论了生物催化在非水环境中而不是在水介质中进行，其重要性和适用性已得到公认[8,9]。近年来，除有机溶剂，已经出现了一种新的有吸引力的在非水反应介质中进行生物催化。室温离子液体（ILS）已经越来越多地被引入作为未来的绿色，高科技的反应介质。那是因为他们缺乏蒸气压，其热稳定性，以及其广泛的调谐性由于极性，疏水性，溶剂混溶性能通过其阳离子和阴离子[10]进行适当的修改。
就在离子液体的酶促反应后的8-9年中，许多研究已经完成并发现，不仅该离子液体是替代挥发性有机溶剂且对环境是友好的，而且，在这样的溶剂，酶显示出包括基质优异的选择性和区域和对映选择性[11]。据报道不同的酶，如脂肪酶[12-14]，蛋白酶[15,16]，过氧化物酶[17]，脱氢酶[18]，和葡萄糖氧化酶[19]在离子液体中悬浮时可以保持其活性，这表明离子液体是非常有前途的绿色的生物转化中替代有机溶剂的介质。尽管脂肪酶在离子液体中的生物催化已被广泛研究，其它酶如蛋白酶或复合酶的应用和动力学行为是非常有限的。此外，在离子液体介质中来自中度嗜盐种酶的行为到目前为止都没有被报道。通常情况下，生长最佳的是介质中含有3-15％的NaCl的中度嗜盐细菌产生耐盐酶是能够处理其环境中的高离子强度（最多4mol/L氯化钠），并同时对比他们的极端嗜盐同类，可以??在无盐的环境下活跃 [20]。因此，研究来自于在离子液体中存在的这组细菌中的酶的行为可能导致的获取分析行业应用的新的酶。
在以前的报告中，我们提出了一个中度嗜盐菌中耐有机溶剂蛋白酶的溶蛋白salinivibrio菌株AF-2004 [21]。在这个研究中，我们纯化和表征另一个来自一株新分离的细菌Salinivibrio sp.的卤代嗜碱微生物蛋白酶。菌株MS-7，来自伊朗高盐度湖泊（Maharlou）。评估和比较讨论了三种不同的离子液体和有机溶剂对酶的酪蛋白的活性和稳定性的影响。
材料和方法
材料与试剂
酪蛋白酶测定，各种无机盐，和来自默克公司（达姆施塔特，德国）培养基成分。具体的蛋白酶抑制剂（抗痛素，苯丁抑制素，胰凝乳蛋白酶抑制剂，E-64，亮肽素，胃蛋白酶抑制剂，磷酸阿米酮，Pefabloc SC，EDTA-二钠，和抑肽酶）购自罗氏诊断公司（德国曼海姆）而获得。对于蛋白酶的纯化，DEAE-纤维素阴离子交换树脂是来自西格玛（圣路易斯，密苏里州，美国）。所有的有机溶剂均为分析纯。离子液体，1 - 丁基-3 - 甲基咪唑溴化物（[BMIM] [BR]），1 - 己基-3 - 甲基咪唑鎓四氟硼酸盐（[C6MIM] [BF4]）和1 - 己基-3 - 甲基咪唑鎓六氟磷酸盐（[C6MIM] [PF 6]）是根据文献报道[22]的方法进行合成。
菌种和培养条件
用于本研究的微生物是从伊朗南部超过15％的盐度的Maharlu盐湖中分离的。在众多的菌株中都有产生胞外蛋白酶的能力，菌株MS-7被选定为最好的生产者。表型分类和16S rRNA基因序列分析将其放入Salinivibrio菌属（提交的文章）。该Salinivibrio SP.菌株MS-7在30℃和180rpm下在需10％的NaCl和25％的自来水补充的营养肉汤培养基中进行需氧培养。用于生产蛋白酶，基础培养基含量（克每升）蛋白胨，10;酵母提取物，5;麦芽糖，5;的NaCl，81;硫酸镁，9.6;氯化镁??，7;氯化钙，0.36;和NaHCO 3，2（pH 8.0）。
酶的分离纯化
所有纯化步骤均在4℃下进行。菌株MS-7的无细胞上清液在培养48小时后，通过9000转每分钟离心10分钟收集的。冷的丙酮溶液缓慢加入到高达40％的饱和度的上清液中，并弃去沉淀物后，将丙酮加入到此时高达80％的饱和度的溶液中在缓慢搅拌下放置30分钟。以12,000转每分钟离心分离20分钟后得到的沉淀物悬浮在含有50毫摩尔每升的NaCl和0.5毫摩尔每升氯化钙最小体积为20mM的Tris–HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）（pH8.0）（缓冲液A）的并在相同的缓冲液中伴随三个缓冲区的变化透析24小时。酶制剂加样在已预先用缓冲液A润洗过的DEAD-纤维素柱（2.5×10厘米）中。洗涤后，直到流出物在280nm处的光密度几乎达到零，柱子的线性梯度用相同的缓冲组合物在（0.05-0.6 mol/L）NaCl中流速为0.5毫升/分钟。活性部分被汇集并储存于-20℃中作为进一步使用纯化的酶。
蛋白酶活性测定
酪蛋白水解活性的测定使用先前报道的以0.5％的浓度的酪蛋白为底物，在
摘要:胞外蛋白酶是从一株新的中度嗜盐菌Salinivibrio SP.菌株MS-7通过丙酮沉淀法（40-80％）步骤和DEAE—纤维素阴离子交换柱层析的结合而纯化得到的。
酶的动力学参数显示的130单位/毫克和 1.14毫克/毫升的Vmax和Km，分别是用酪蛋白作为底物。21-kDa蛋白酶的生物化学特性的温度和pH最适点分别为50℃和8.0。苯甲基磺酰氟，Pefabloc SC，胰凝乳蛋白酶抑制剂和EDTA对该酶具有强烈的抑制作用，这表明它属于类丝氨酸金属蛋白酶。有趣的是，Ba2 +和Ca2 +（2 g/mol）能较强的增强酶的活性，而Fe2 +和Mg2 +对酶的活性中等而Zn2 +，Ni2 +和Hg2 +则使酶的活性减少。不同的logP对纯化蛋白酶的有机溶剂的影响表现为在甲苯，乙酸乙酯，氯仿和在10和50％（V / V）的正己烷中有完整的稳定性即使在50％的DMSO（二甲基亚砜）和乙醇中也具有中等稳定性。MS-7蛋白酶在3咪唑鎓系离子液体的行为，在这些绿色溶剂体系，特别是在1 - 己基-3 - 甲基咪唑鎓六氟磷酸盐（[C6MIM] [PF 6]）中表现出适当的活性。纯化的蛋白酶与其他先前报道的蛋白酶相比较表明，菌株MS-7隐秘的新型耐有机溶剂的蛋白酶在有机溶剂中和咪唑鎓系离子液体中具有杰出的活性，这可能会被应用在工业生物技术的低水合成部。
*查看完整论文请+Q: 351916072
关键词 Salinivibrio sp.菌株 MS-7 离子液体 中度嗜盐菌 有机溶剂 蛋白酶
介绍 微生物蛋白酶因为在生理过程中的重要作用[1]，广泛的生化多样性，他们的分析和工业应用[2,3]，和可行性批量生产以及遗传操作简易性吸引了世界各地研究人员的关注。蛋白酶在洗涤剂中，皮革，丝绸，面包，豆制品加工，肉类嫩化，和酿酒行业的应用是有据可查的[4,5]。另一方面，在有机溶剂和离子液体中的蛋白酶的操作是生物技术和生物化学的一个有趣的显影区域[6]。蛋白酶可以催化合成反应，这是水解的逆反应，而且转酯化反应用合适的立体定向性和不需要以化学合成的方法保护侧链 [7]。然而，在有机介质中蛋白酶使用于肽，酯，和其它生物活性有机分子的合成受到这些酶在有机溶剂存在下的不稳定性限制。在过去20多年中广泛的讨论了生物催化在非水环境中而不是在水介质中进行，其重要性和适用性已得到公认[8,9]。近年来，除有机溶剂，已经出现了一种新的有吸引力的在非水反应介质中进行生物催化。室温离子液体（ILS）已经越来越多地被引入作为未来的绿色，高科技的反应介质。那是因为他们缺乏蒸气压，其热稳定性，以及其广泛的调谐性由于极性，疏水性，溶剂混溶性能通过其阳离子和阴离子[10]进行适当的修改。
就在离子液体的酶促反应后的8-9年中，许多研究已经完成并发现，不仅该离子液体是替代挥发性有机溶剂且对环境是友好的，而且，在这样的溶剂，酶显示出包括基质优异的选择性和区域和对映选择性[11]。据报道不同的酶，如脂肪酶[12-14]，蛋白酶[15,16]，过氧化物酶[17]，脱氢酶[18]，和葡萄糖氧化酶[19]在离子液体中悬浮时可以保持其活性，这表明离子液体是非常有前途的绿色的生物转化中替代有机溶剂的介质。尽管脂肪酶在离子液体中的生物催化已被广泛研究，其它酶如蛋白酶或复合酶的应用和动力学行为是非常有限的。此外，在离子液体介质中来自中度嗜盐种酶的行为到目前为止都没有被报道。通常情况下，生长最佳的是介质中含有3-15％的NaCl的中度嗜盐细菌产生耐盐酶是能够处理其环境中的高离子强度（最多4mol/L氯化钠），并同时对比他们的极端嗜盐同类，可以??在无盐的环境下活跃 [20]。因此，研究来自于在离子液体中存在的这组细菌中的酶的行为可能导致的获取分析行业应用的新的酶。
在以前的报告中，我们提出了一个中度嗜盐菌中耐有机溶剂蛋白酶的溶蛋白salinivibrio菌株AF-2004 [21]。在这个研究中，我们纯化和表征另一个来自一株新分离的细菌Salinivibrio sp.的卤代嗜碱微生物蛋白酶。菌株MS-7，来自伊朗高盐度湖泊（Maharlou）。评估和比较讨论了三种不同的离子液体和有机溶剂对酶的酪蛋白的活性和稳定性的影响。
材料和方法
材料与试剂
酪蛋白酶测定，各种无机盐，和来自默克公司（达姆施塔特，德国）培养基成分。具体的蛋白酶抑制剂（抗痛素，苯丁抑制素，胰凝乳蛋白酶抑制剂，E-64，亮肽素，胃蛋白酶抑制剂，磷酸阿米酮，Pefabloc SC，EDTA-二钠，和抑肽酶）购自罗氏诊断公司（德国曼海姆）而获得。对于蛋白酶的纯化，DEAE-纤维素阴离子交换树脂是来自西格玛（圣路易斯，密苏里州，美国）。所有的有机溶剂均为分析纯。离子液体，1 - 丁基-3 - 甲基咪唑溴化物（[BMIM] [BR]），1 - 己基-3 - 甲基咪唑鎓四氟硼酸盐（[C6MIM] [BF4]）和1 - 己基-3 - 甲基咪唑鎓六氟磷酸盐（[C6MIM] [PF 6]）是根据文献报道[22]的方法进行合成。
菌种和培养条件
用于本研究的微生物是从伊朗南部超过15％的盐度的Maharlu盐湖中分离的。在众多的菌株中都有产生胞外蛋白酶的能力，菌株MS-7被选定为最好的生产者。表型分类和16S rRNA基因序列分析将其放入Salinivibrio菌属（提交的文章）。该Salinivibrio SP.菌株MS-7在30℃和180rpm下在需10％的NaCl和25％的自来水补充的营养肉汤培养基中进行需氧培养。用于生产蛋白酶，基础培养基含量（克每升）蛋白胨，10;酵母提取物，5;麦芽糖，5;的NaCl，81;硫酸镁，9.6;氯化镁??，7;氯化钙，0.36;和NaHCO 3，2（pH 8.0）。
酶的分离纯化
所有纯化步骤均在4℃下进行。菌株MS-7的无细胞上清液在培养48小时后，通过9000转每分钟离心10分钟收集的。冷的丙酮溶液缓慢加入到高达40％的饱和度的上清液中，并弃去沉淀物后，将丙酮加入到此时高达80％的饱和度的溶液中在缓慢搅拌下放置30分钟。以12,000转每分钟离心分离20分钟后得到的沉淀物悬浮在含有50毫摩尔每升的NaCl和0.5毫摩尔每升氯化钙最小体积为20mM的Tris–HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）（pH8.0）（缓冲液A）的并在相同的缓冲液中伴随三个缓冲区的变化透析24小时。酶制剂加样在已预先用缓冲液A润洗过的DEAD-纤维素柱（2.5×10厘米）中。洗涤后，直到流出物在280nm处的光密度几乎达到零，柱子的线性梯度用相同的缓冲组合物在（0.05-0.6 mol/L）NaCl中流速为0.5毫升/分钟。活性部分被汇集并储存于-20℃中作为进一步使用纯化的酶。
蛋白酶活性测定
酪蛋白水解活性的测定使用先前报道的以0.5％的浓度的酪蛋白为底物，在
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