奶酪蛋白對茶中的多酚类化合物的影响
奶酪蛋白对茶中的多酚类化合物的影响
摘要:本实验研究了酪蛋白(牛奶蛋白)对茶中具有抗氧化效果的游离茶多酚浓度的影响.本实验采用了胶束电动色谱法,结果表明,在茶中加入牛奶会降低游离茶多酚的浓度,因为茶多酚会与牛奶酪蛋白结合.
多酚是I.种来源于植物的有机化合物,它是有效的天然抗氧化剂.多酚广泛存在于蔬菜,水果,玉米,调味品,酒,红茶和绿茶(在绿茶中的浓度要高得多),咖啡和可可中,它们具有抗癌,抗菌,抗炎等作用.
茶是世界上最普遍的饮料.茶叶是I.种特殊的植物,其中含有大量对人体健康有影响的物质.茶中含有的多酚化合物浓度非常高,这是其化学特性之I..茶中含有的主要多酚是儿茶酚类或黄烷-III-醇类((+)-邻苯II酚,(-)-表儿茶酚,(-)-表没食子儿茶素,(-)-表儿茶酚没食子酸酯,(-)-右旋没食子儿茶精没食子酸酯,(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯),还有没食子酸.
饮用茶饮料可以减少心血管疾病的风险.然而,最近有研究表明,在茶中加入牛奶会显著降低这种效果.这是由于邻苯II酚和酪蛋白(α-,β-,和κ-酪蛋白,具有磷酸化结构的物质)反应形成复合物而引起的.I.项关于牛奶中的各种蛋白(α-,β-和κ-酪蛋白,α-,β-乳白蛋白,白蛋白)对茶的影响的专题研究表明,酪蛋白是所有牛奶蛋白中对茶的影响最大的I.种.
最近,我们开发了I.个程序,通过胶束电动色谱(MEKC)来分析不同种类的绿茶和红茶.
在这项工作中,我们采用MEKC法,研究了加入牛奶对不同种类的茶中的多酚化合物浓度的影响.
I.实验
在分析过程中,本实验使用I.个KAPEL型I.0V毛细管电泳系统,以及I.台分光光度计(II00nm~IV00nm),该分光光度计配备有聚酰亚胺涂层的石英毛细管,内径为VIIVμm,有效长度为V0cm(总长度为VI0cm). *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
该分光光度计的工作温度为-II0℃,在II00nm处进行检测.
多酚和酪蛋白的吸收光谱采用岛津UV-I.VII00分光光度计进行记录.
实验材料包括酪蛋白的标准样品(α-,β-和κ-酪蛋白的混合物),以及各种多酚((+)-邻苯II酚,(-)-表儿茶酚,(-)-表儿茶酚没食子酸酯,(-)-表没食子儿茶酚,(-)-右旋没食子儿茶精没食子酸酯,(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯),还有没食子酸,以上材料均从Fluka公司和Sigma公司购买;HCl,NaOH,XII烷基硫酸钠(SDS)(均为试剂级),NaIIHPOIV·I.IIHIIO和NaHIIPOIV·HIIO,以上试剂均从REATEK公司购买.
用来测定多酚化合物的缓冲电解质(BE)是由pH=VII.0的IIVmM磷酸盐缓冲液加上IIVmM的SDS制备而成.待测样品在III0mbar的压力下,通过流体动力的作用,在I.0s内被引入.分析物在正极(+IIVkV)电泳分离.使用前,将石英毛细管用I.M的HCl和蒸馏水洗涤I.0min,然后用0.VM的NaOH洗涤,最后再用蒸馏水洗涤I.0分钟.毛细管在每两次实验之间都要用缓冲液溶液洗涤IIImin.
酪蛋白与茶多酚结合的研究,采用的是纯酪蛋白的水溶液,以及浓度分别为I.V0mg/L和II0mg/L的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯溶液.浓度低于I.V0mg/L的酪蛋白溶液将通过稀释获得.
茶的制备是在II0mL的IX0℃的热水中加入II00mg的茶叶样品,然后水浴加热II0min,冷却,并用醋酸纤维素过滤器(Millipore公司,0.IIVμm)对茶汁进行过滤.绿茶和红茶分别稀释成电泳之前的I./I.0和I./II.
在室温下,在茶中加入V?I.0％的牛奶,操作方法和上述方法类似.
II结果与讨论
我们得到的酪蛋白标准溶液的电泳图,其中的I.种儿茶酚_(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯_表现出了最大的抗氧化活性(氧化电势是VIIII0μV),比茶中以及样品中所含有的其它茶多酚都要强.所使用的标准溶液的浓度与(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯和牛奶含量为I.0%的茶汁中所含有的酪蛋白的含量之比成比例关系.实验证明,在这种情况下,酪蛋白是过量的,并且会与(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯结合.在儿茶酚和酪蛋白的混合样品的电泳图中,酪蛋白的电泳峰消失了.
为了研究蛋白质-多酚复合物的形成,本实验将蛋白质浓度降低到IIImg/L.在这些实验中,(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度几乎是恒定的.在酪蛋白浓度为I.Vmg/L时,增加了混合物中酪蛋白的比重,便导致游离儿茶酚的浓度降低到了I.mg/L(图II).由图III可以看出,(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯对蛋白质与儿茶酚的比例起决定性作用.
为了确认酪蛋白与多酚类物质的相互作用,我们在紫外和可见光区域测得了(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯.酪蛋白.以及两者混合物的电子吸收光谱(图IV).
本实验中对实物,绿茶和红茶(图V)进行了分析验证.下表显示出了加入牛奶后茶中生物活性成分含量的变化,还显示出了多酚与奶蛋白会互相结合.而如果没食子酸酯(ECG和EGCG),则茶中的生物活性成分会更大程度地与其它化合物结合.
茶多酚在绿茶和红茶中加入牛奶后的浓度变化(P=0.IXV,N=III)
分析多酚含量,％多酚含 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
量,％
绿茶绿茶加入牛奶红茶红茶加入牛奶
CafII.I.±0.III..I.0±0.0IXI..V±0.I.0.IXV±0.0IX
EGCI..VII±0.I.0.VVII±0.0VI<0.0I.<0.0I.
EGCGIII.IV±0.III0.VV±0.0VI0.I.0±0.0I.<0.0I.
EC0.VIIIIII±0.0VIII0.IIVIII±0.0IV0.0IX±0.0I.0.0VII±0.0I.
GA0.0VIII±0.0II0.0IV±0.0I.0.I.IV±0.0II0.0VI±0.0I.
ECGII.III±0.II0.IVI.±0.0V0.I.VIII±0.0III0.I.I.±0.0II
根据实验结果(表)和儿茶酚的结构特征(图I.),我们可以推断,两者是因为儿茶酚分子的酚I.,II-羟基基团而结合.邻苯III酚片段(III个相邻的OH基)的存在基本上不改变蛋白结合的程度.
图I.主要茶多酚和咖啡因的化学结构
图II表没食子儿茶素没食子酸酯(II0mg/L)和酪蛋白在浓度为0mg/L(a)图,IIImg/L(b)图,IXmg/L(c)图和I.Vmg/L的(D)图的混合样品电泳图.条件:BE,IIVmM磷酸盐缓冲液,pHVII.0,IIVmM的SDS;II00纳米.
图III游离的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度在酪蛋白混合物中的比例关系
图IV吸收光谱,曲线(I.)表示(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(IIImg/L)的吸收光谱,曲线(II)表示酪蛋白(II0mg/L)的吸收光谱,曲线(III)表示(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(IIImg/L)与酪蛋白(II0mg/L)混合物的吸收光谱
图V电泳图,绿茶(a),绿茶加如V%奶(b),红茶(c),红茶加如V%奶(d)
(I.)Caf,(II)EGC,(III)EGCG,(IV)EC,(V)ECG.条件与图II相同
附件II:外文原文(复印件)
摘要:本实验研究了酪蛋白(牛奶蛋白)对茶中具有抗氧化效果的游离茶多酚浓度的影响.本实验采用了胶束电动色谱法,结果表明,在茶中加入牛奶会降低游离茶多酚的浓度,因为茶多酚会与牛奶酪蛋白结合.
多酚是I.种来源于植物的有机化合物,它是有效的天然抗氧化剂.多酚广泛存在于蔬菜,水果,玉米,调味品,酒,红茶和绿茶(在绿茶中的浓度要高得多),咖啡和可可中,它们具有抗癌,抗菌,抗炎等作用.
茶是世界上最普遍的饮料.茶叶是I.种特殊的植物,其中含有大量对人体健康有影响的物质.茶中含有的多酚化合物浓度非常高,这是其化学特性之I..茶中含有的主要多酚是儿茶酚类或黄烷-III-醇类((+)-邻苯II酚,(-)-表儿茶酚,(-)-表没食子儿茶素,(-)-表儿茶酚没食子酸酯,(-)-右旋没食子儿茶精没食子酸酯,(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯),还有没食子酸.
饮用茶饮料可以减少心血管疾病的风险.然而,最近有研究表明,在茶中加入牛奶会显著降低这种效果.这是由于邻苯II酚和酪蛋白(α-,β-,和κ-酪蛋白,具有磷酸化结构的物质)反应形成复合物而引起的.I.项关于牛奶中的各种蛋白(α-,β-和κ-酪蛋白,α-,β-乳白蛋白,白蛋白)对茶的影响的专题研究表明,酪蛋白是所有牛奶蛋白中对茶的影响最大的I.种.
最近,我们开发了I.个程序,通过胶束电动色谱(MEKC)来分析不同种类的绿茶和红茶.
在这项工作中,我们采用MEKC法,研究了加入牛奶对不同种类的茶中的多酚化合物浓度的影响.
I.实验
在分析过程中,本实验使用I.个KAPEL型I.0V毛细管电泳系统,以及I.台分光光度计(II00nm~IV00nm),该分光光度计配备有聚酰亚胺涂层的石英毛细管,内径为VIIVμm,有效长度为V0cm(总长度为VI0cm). *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
该分光光度计的工作温度为-II0℃,在II00nm处进行检测.
多酚和酪蛋白的吸收光谱采用岛津UV-I.VII00分光光度计进行记录.
实验材料包括酪蛋白的标准样品(α-,β-和κ-酪蛋白的混合物),以及各种多酚((+)-邻苯II酚,(-)-表儿茶酚,(-)-表儿茶酚没食子酸酯,(-)-表没食子儿茶酚,(-)-右旋没食子儿茶精没食子酸酯,(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯),还有没食子酸,以上材料均从Fluka公司和Sigma公司购买;HCl,NaOH,XII烷基硫酸钠(SDS)(均为试剂级),NaIIHPOIV·I.IIHIIO和NaHIIPOIV·HIIO,以上试剂均从REATEK公司购买.
用来测定多酚化合物的缓冲电解质(BE)是由pH=VII.0的IIVmM磷酸盐缓冲液加上IIVmM的SDS制备而成.待测样品在III0mbar的压力下,通过流体动力的作用,在I.0s内被引入.分析物在正极(+IIVkV)电泳分离.使用前,将石英毛细管用I.M的HCl和蒸馏水洗涤I.0min,然后用0.VM的NaOH洗涤,最后再用蒸馏水洗涤I.0分钟.毛细管在每两次实验之间都要用缓冲液溶液洗涤IIImin.
酪蛋白与茶多酚结合的研究,采用的是纯酪蛋白的水溶液,以及浓度分别为I.V0mg/L和II0mg/L的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯溶液.浓度低于I.V0mg/L的酪蛋白溶液将通过稀释获得.
茶的制备是在II0mL的IX0℃的热水中加入II00mg的茶叶样品,然后水浴加热II0min,冷却,并用醋酸纤维素过滤器(Millipore公司,0.IIVμm)对茶汁进行过滤.绿茶和红茶分别稀释成电泳之前的I./I.0和I./II.
在室温下,在茶中加入V?I.0％的牛奶,操作方法和上述方法类似.
II结果与讨论
我们得到的酪蛋白标准溶液的电泳图,其中的I.种儿茶酚_(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯_表现出了最大的抗氧化活性(氧化电势是VIIII0μV),比茶中以及样品中所含有的其它茶多酚都要强.所使用的标准溶液的浓度与(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯和牛奶含量为I.0%的茶汁中所含有的酪蛋白的含量之比成比例关系.实验证明,在这种情况下,酪蛋白是过量的,并且会与(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯结合.在儿茶酚和酪蛋白的混合样品的电泳图中,酪蛋白的电泳峰消失了.
为了研究蛋白质-多酚复合物的形成,本实验将蛋白质浓度降低到IIImg/L.在这些实验中,(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度几乎是恒定的.在酪蛋白浓度为I.Vmg/L时,增加了混合物中酪蛋白的比重,便导致游离儿茶酚的浓度降低到了I.mg/L(图II).由图III可以看出,(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯对蛋白质与儿茶酚的比例起决定性作用.
为了确认酪蛋白与多酚类物质的相互作用,我们在紫外和可见光区域测得了(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯.酪蛋白.以及两者混合物的电子吸收光谱(图IV).
本实验中对实物,绿茶和红茶(图V)进行了分析验证.下表显示出了加入牛奶后茶中生物活性成分含量的变化,还显示出了多酚与奶蛋白会互相结合.而如果没食子酸酯(ECG和EGCG),则茶中的生物活性成分会更大程度地与其它化合物结合.
茶多酚在绿茶和红茶中加入牛奶后的浓度变化(P=0.IXV,N=III)
分析多酚含量,％多酚含 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
量,％
绿茶绿茶加入牛奶红茶红茶加入牛奶
CafII.I.±0.III..I.0±0.0IXI..V±0.I.0.IXV±0.0IX
EGCI..VII±0.I.0.VVII±0.0VI<0.0I.<0.0I.
EGCGIII.IV±0.III0.VV±0.0VI0.I.0±0.0I.<0.0I.
EC0.VIIIIII±0.0VIII0.IIVIII±0.0IV0.0IX±0.0I.0.0VII±0.0I.
GA0.0VIII±0.0II0.0IV±0.0I.0.I.IV±0.0II0.0VI±0.0I.
ECGII.III±0.II0.IVI.±0.0V0.I.VIII±0.0III0.I.I.±0.0II
根据实验结果(表)和儿茶酚的结构特征(图I.),我们可以推断,两者是因为儿茶酚分子的酚I.,II-羟基基团而结合.邻苯III酚片段(III个相邻的OH基)的存在基本上不改变蛋白结合的程度.
图I.主要茶多酚和咖啡因的化学结构
图II表没食子儿茶素没食子酸酯(II0mg/L)和酪蛋白在浓度为0mg/L(a)图,IIImg/L(b)图,IXmg/L(c)图和I.Vmg/L的(D)图的混合样品电泳图.条件:BE,IIVmM磷酸盐缓冲液,pHVII.0,IIVmM的SDS;II00纳米.
图III游离的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度在酪蛋白混合物中的比例关系
图IV吸收光谱,曲线(I.)表示(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(IIImg/L)的吸收光谱,曲线(II)表示酪蛋白(II0mg/L)的吸收光谱,曲线(III)表示(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(IIImg/L)与酪蛋白(II0mg/L)混合物的吸收光谱
图V电泳图,绿茶(a),绿茶加如V%奶(b),红茶(c),红茶加如V%奶(d)
(I.)Caf,(II)EGC,(III)EGCG,(IV)EC,(V)ECG.条件与图II相同
附件II:外文原文(复印件)
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